Autoimmune PAR2 activation in vascular events

Abstract

Background: Antibodies targeting endothelial G protein-coupled receptors (GPCRs), such as Protease-activated receptor 2 (PAR2), bridge antibody-mediated rejection through endothelial pathology. Previous results from Prof. Dragun´s lab show that antibodies targeting PAR2 (KTx- IgG) can regulate vascular formation in kidney transplant recipients, indicating that PAR2 antibodies might be involved in transplant rejections. However, the structural basis of antibodies interacting with PAR2 in endothelial cells and the specific signaling pathways involved are still unknown. Methods: The three extracellular loops (ECL) of PAR2 were mutated respectively to study their involvement in trypsin and KTx-IgG-induced PAR2 activation and downstream signaling. Two systems were adopted for the functional analyses. The MMY system is based on engineered yeasts, in which the activation of G-proteins can be observed by monitoring the yeast growth. Another system applied in human endothelial cells (HMEC-1) is the luciferase reporter system, which makes the autoantibody-induced transcription detectable. Results: KTx-IgG partially activated PAR2. Trypsin and KTx-IgG activated Gα12, but not Gαq in the MMY system. In contrast, in HMEC-1 both Gαq and Gα12 were activated by trypsin and KTx- IgG. Mutation of ECL1 eliminated the trypsin-induced Gαq activation and lowered the KTx-IgGinduced Gαq activation. ECL2 was also shown to be also important in trypsin-induced Gαq activation. However, mutation of ECL2 enhanced the KTx-IgG-induced Gα12 and ERK activation. ECL3 mutation attenuated trypsin-induced Gαq activation and the baseline activation of Gα12, but had only small effects on KTx-IgG-induced PAR2 activation. PAR2-activating peptide and KTx-IgG also activated Gi in the yeast system. Inhibition of Gi downregulated trypsin-induced Gαq activation. Conclusion: The study explored autoantibodies and natural agonist-induced PAR2 downstream signaling and the extracellular binding loops involved in the MMY system and mammalian endothelial cells. The results provide a rationale for further development of drugs targeting specific ECLs of PAR2 or PAR2 downstream signaling to improve the prognosis and life expectancy of kidney transplantation patients..

Hintergrund: Autoantikörper, die endotheliale G Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), wie den Protease aktivierten Rezeptor 2 (PAR2) aktivieren, können über endotheliale Störungen zur Transplantatrejektion führen. Frühere Ergebnisse der AG Prof. Dragun zeigten, dass Autoantikörper, die PAR2 (NTx-IgG) aktivieren, die Gefäßbildung in Nierentransplantat-empfängern regulieren und damit an einer Transplantatrejektion beteiligt sein könnten. Jedoch war es bisher völlig unbekannt, welche strukturellen Interaktionen zwischen den Autoantikörpern und PAR2 und welche spezifischen Signalwege dabei in den Endothelzellen eine Rolle spielen. Methoden: Um die durch den natürlichen Liganden von PAR2 Trypsin und die NTx-IgG induzierte Aktivierung von PAR2, sowie nachfolgende Signalwege zu untersuchen, wurden die drei extrazellulären Loops (ECL) von PAR2 mutiert. Zur Bestimmung der funktionellen Bedeutung dieser Mutationen wurden zwei unterschiedliche Assays eingesetzt. Zum einen wurde das MMYHefesystem verwendet, das auf gentechnisch veränderten Hefen beruht und bei dem die Aktivierung eines G-Proteins direkt anhand des Wachstums der Hefen gemessen werden kann. Die zweite Methode, die in humanen Endothelzellen (HMEC-1) etabliert wurde, ist das Luziferase Reporter System, womit eine autoantikörperinduzierte Transkription detektiert werden kann. Ergebnisse: NTx-IgG aktivierte PAR2. Im MMY-Hefesystem kam es durch Trypsin und NTx-IgG zu einer Aktivierung von Gα12, nicht jedoch von Gαq. Im Gegensatz dazu wurden in HMEC-1 sowohl Gαq, als auch Gα12 durch Trypsin und NTx-IgG aktiviert. Die Mutation des ECL1 verhinderte die Gαq-Aktivierung durch Trypsin und reduzierte diejenige durch NTx-IgG. Darüberhinaus zeigte sich, dass für die Gαq-Aktivierung durch Trypsin auch der ECL2 wichtig ist. Jedoch führte die ECL2 Mutation zu einer verstärkten Aktivierung von Gα12 and ERK bei der Zellstimulation durch NTx-IgG. Die Mutation des ECL3 verminderte sowohl die trypsininduzierte Gαq-Aktivierung als auch die basale Aktivierung von Gα12, hatte aber nur einen geringen Einfluss auf die NTx-IgG induzierte PAR2 Aktivierung. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass das PAR2 aktivierende Peptid und NTx-IgG im Hefesystem Gi aktivieren. Die Hemmung von Gi reduzierte die Gαq-Aktivierung durch Trypsin. Zusammenfassung: In dieser Studie wurden sowohl die Aktivierung von Signalwegen als auch die Bindung an extrazelluläre Loops von PAR2 durch Autoantikörper und natürliche Aktivatoren im MMY Hefesystem und in humanen Endothelzellen untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern erste Erkenntnisse für potenzielle drug targets, die spezifisch gegen die ECLs von PAR2 und PAR2 abhängige Signalwege gerichtet sind. Dies könnte die Prognose und Lebenserwartung für nierentransplantierte Patienten verbessern.