Effekte einer Interleukin-10 Überexpression in humanen Gelenkchondrozyten und Interaktion von Interleukin-10 mit Tumor Nekrose Faktor-α

Abstract

Die Arthrose ist eine degenerative Gelenkknorpelerkrankung, die durch eine fortschreitende irreversible Knorpeldestruktion gekennzeichnet ist. Vielfältige katabole Prozesse, die im arthrotischen Knorpel beschrieben sind, werden durch pro-inflammatorische Zytokine wie Interleukin (IL)-1β und den Tumor Nekrose Faktor (TNF)-α vermittelt. Eine Hemmung der Neusynthese extrazellulärer Knorpelmatrixproteine, eine vermehrte Freisetzung von katabolen Enzymen und entzündlichen Zytokinen sowie apoptotische Prozesse in den Chondrozyten. In diesem Projekt wurde daher untersucht, welche Auswirkungen das immunregulatorische Zytokin IL-10 auf die Zellbiologie der Chondrozyten hat. Dabei sollte auch die Frage geklärt werden, ob IL-10 die katabolen Effekte, die von TNF-α in Knorpelzellkulturen induziert werden, beeinflussen kann. Daher wurde die Genexpression von knorpelspezifischen Matrixkomponenten (Kollagen Typ II, Aggrekan), Enzymen die den Knorpelmatrixabbau vermitteln (Matrix Metalloproteinasen [MMP-3 und MMP-13]) und wichtigen inflammatorischen Zytokinen (IL-1β, TNF-α, IL-6, IL-10) untersucht. Des Weiteren wurde der Einfluß von IL-10 auf Apoptosemarker (Caspaseaktivitäten, bax/bcl-2 Synthese) in Chondrozyten bestimmt. Die Untersuchungen erfolgten durch Stimulation humaner Chondrozytenkulturen mit rekombinantem humanem TNF-α, IL-10 und in einem adenoviralen IL-10 Überexpressionsmodell. In 3D-Knorpelzellkulturen wurde daher auch parallel der Einfluss der IL-10 Überexpression auf den differenzierten Phänotyp der Chondrozyten über zwei Wochen überprüft. Die Ergebnisse zeigten: Trotz einer stimulatorischen Wirkung von IL-10 auf die Kollagen Typ II Genexpression blieb die durch TNF-α supprimierte Expression dieses essentiellen Knorpelmatrixbestandteils durch IL-10 kaum beeinflusst. Allerdings konnte die durch TNF-α signifikant verminderte Genexpression von Aggrekan wieder aufgehoben werden. Ähnliche antagonistische Tendenzen zwischen IL-10 und TNF-α wurden auch hinsichtlich der Genexpression von MMP-3 und -13 nachgewiesen. Auch konnte die durch TNF-α vermehrte IL-1β, TNF-α und IL-6 Expression durch IL-10 gesenkt werden. IL-10 hemmte zudem die TNF-α induzierte Apoptose über eine Verminderung der Aktivitäten von Caspasen, die in intrinsische und extrinsische mitochondriale Apoptosewege eingebundenen sind und über ein signifikant günstigeres Verhältnis der regulatorischen Proteine bax und bcl-2. IL-10 ist daher nicht in der Lage, die von TNF-α induzierten katabolen Prozesse in Chondrozytenkulturen aufzuheben, zeigt jedoch einige antagonistische und damit chondroprotektive Effekte. Transduzierte Chondrozyten exprimierten das Transgen über einen Zeitraum von mindestens zwei Wochen in den 3D-Kulturen und eine IL-10 Überexpression übte hier keine katabolen Wirkungen auf die Kollagen Typ II, Aggrekan, Kollagen Typ I, Fibronektin und β1-Integrin Proteinexpression aus.

Osteoarthritis (OA) is a progressive degenerative cartilage disease that leads to irreversible cartilage loss, joint pain and dysfunction. Pro-inflammatory cytokines such as interleukin (IL)-1β and tumour necrosis factor (TNF)-α play a crucial role in the pathogenesis of OA. These cytokines initiate a cascade of catabolic and inflammatory events leading to suppressed synthesis of cartilage-specific matrix components, breakdown of the cartilage matrix by degradative enzymes such as matrix-metalloproteinases (MMPs), enhanced synthesis of pro-inflammatory cytokines and the induction of chondrocyte apoptosis. The aim of the present study was to determine whether IL-10 plays a role in chondrocyte biology and whether IL-10 has the ability to modulate TNF-α induced catabolic events in human articular chondrocytes. Gene expression of cartilage specific extracellular matrix components (type II collagen, aggrecan), matrix degrading enzymes (matrix metalloproteinases [MMP-3 and -13]) and important pro-inflammatory cytokines was analysed. Furthermore, the influence of IL-10 on chondrocyte apoptosis (caspase activities, bax/bcl-2 synthesis) was investigated. Human articular chondrocytes were stimulated in monolayer cultures with recombinant human TNF-α, IL-10 or were transduced with an adenoviral IL-10 overexpression vector. Subsequently, in 3D chondrocyte cultures the influence of the IL-10 overexpression on the differentiated phenotype of the chondrocytes was also checked over two weeks. The results showed: Despite a stimulatory effect of IL-10 on type II collagen gene expression was observed downregulation of this essential cartilage matrix component by TNF-α remained hardly influenced by IL-10. On contrary, the suppression of aggrecan gene expression by TNF-α could be significantly inhibited by IL-10. Similar antagonisms between IL-10 and TNF-α were also found concerning MMP-3 and -13 gene expression. The increase in IL-1β, TNF-α and IL-6 gene expression mediated by TNF-α could be suppressed by IL-10. Moreover, IL-10 restrained TNF-α induced apoptosis leading to a decrease in the activities of caspases which are involved in intrinsic and extrinsic apoptotic pathways and to a significantly more favorable relation of the regulatory proteins bax and bcl-2. IL-10 is not able to completely suppress TNF-α induced catabolic processes in chondrocyte cultures, nevertheless, it shows some antagonistic and therefore chondroprotective effects. Transducted chondrocytes were able to synthesize the transgene for a period of at least two weeks in the 3D cultures and IL-10 overexpression had here no catabolic effects on protein expression of type II and I collagen, aggrecan, fibronectin and β1-integrin.