Vorkommen und Verteilung peptiderger Neurotransmitter in hippocampalen Zellkulturen

Abstract

Die innere Struktur des Hippocampus, insbesondere der Aufbau von Neuronenschaltkreisen, ist Gegenstand der aktuellen Forschung. Die hippocampale Primärkultur stellt ein geeignetes Modell zur Untersuchung der neuronalen Entwicklung sowie der Auswirkung isolierter Reize und Noxen dar. Schwerpunkt der nachfolgenden Betrachtungen sind die Neurone des Hippocampus, insbesondere die peptidergen Neurotransmitter Somatostatin (SS), Neuropeptid Y (NPY), Vasoaktives intestinales Peptid (VIP) und Cholecystokinin (CCK). Durch den Gehalt an peptidergen Neurotransmittern lassen sich Interneurone subklassifizieren. Untersuchungen zur Ausprägung peptiderger Neurotransmitter in Interneuronen embryonaler Primärkulturen des Hippocampus liegen bisher nicht vor. In dieser Arbeit wurde das Modell der hippocampalen, embryonalen Primärkultur auf die peptidergen Neurotransmitter ausgeweitet. 1\. Die Unterregionen Gyrus dentatus (G.dent) und CA3a/CA3b wurden getrennt kultiviert. Die vorhandenen Neurone wurden in situ wie in vitro auf ihren Gehalt an peptidergen Neurotransmittern SS, NPY, VIP und CCK analysiert und miteinander verglichen. Zusätzlich wurden in den Kulturen diese Neurotransmitter auf Kolokalisation mit Glutamatdecarboxylase (GAD65), einem Marker GABAerger Neurone überprüft. 2\. Es zeigt sich, dass in den Kulturen die peptidergen Neurotransmitter NPY, VIP, CCK und SS exprimiert werden. Sie werden in unterschiedlichem Maße in den Kulturen vom gesamten Hippokampus, der CA3a/CA3b und des G.dent. ausgeprägt. Die Experimente belegen, dass entgegen der weithin angenommenen GABAergen Natur hippocampaler Interneurone ein signifikanter Anteil NPY-, VIP- und CCKerger Neurone nicht GABAerg sind. Bei SS gibt es diese Abweichung nicht. Bei NPY wurde nur ein kleiner Prozentsatz nicht GABAerger Neurone in der Hippocampus- (16,3%) und G.dent.-Kultur (6,7%) identifiziert. In den untersuchten VIP- und CCK-Populationen überwiegt der Anteil nicht GABAerger Neurone in der Hippocampus- (71,3% VIP; 82,7% CCK) und G.dent.-Kultur (61,7% VIP; 63,8% CCK) bei VIP auch in der CA3a/CA3b-Kultur (85,8%). Die fehlenden Afferenzen und die nicht vorhandene laminäre Schichtung in der Zellkultur sind für diese Unterschiede gegenüber den in-situ Verhältnissen verantwortlich. 3\. An gekindelten Ratten und Kontrolltieren wurden markierte NPY- und SSerge Neurone verglichen. Bei NPYergen Neuronen zeigt sich eine signifikante Zunahme in der Neuronendichte der CA3-Region und eine signifikante Abnahme im Gyrus dentatus. 4\. Es wurde untersucht, ob in der Kultur bei Deltamethringabe ähnliche Effekte zu beobachten sind wie an gekindelten Ratten. An der Kultur ist die Auswirkung unterschiedlicher Konzentrationen von Deltamethrin auf die Neuronensubpopulationen analysiert worden. Dabei wurden zum ersten Mal Konzentrationen von Deltamethrin eingesetzt, die für die Humantoxikologie relevant sind. Die Untersuchungen zeigen eine ähnliche Veränderung der peptidergen Interneurone unter Deltamethringabe wie beim Kindling. Die NPY-Expression wurde massiv gesteigert, während SS-positive Interneurone sich signifikant verringerten. Es ist eine signifikante Abnahme von synaptischen Kontakten an Pyramidenzellen festzustellen. Deltamethrin wirkt in den verwendeten Konzentrationen nicht an Natriumkanälen. Deltamethrin führt in den Kulturen zu ähnlichen Veränderungen, wie bei Zuständen erhöhter Erregbarkeit durch Epilepsie, Kindling- oder Kainic-Säure-Experimenten. Diese Arbeit zeigt, wie variabel ein neuronales Netzwerk in der Entwicklung und im adulten Zustand Neurotransmitter exprimiert und wie stark es dabei auf Afferenzen und laminäre Schichtung angewiesen ist. Es wird ebenfalls gezeigt, wie plastisch der Hippocampus in situ und Kultur auf veränderte Bedingungen wie beim Kindling und der Deltamethrinbehandlung die Neurotransmittersubsets (Ausprägungen) anpaßt.

The internal structure of the hippocampus, especially the development of neuronal circuits, is the subject of current research. The hippocampal primary culture represents a suitable model to study neuronal development and the impact of isolated stimuli and noxious. Focus of the following considerations are the neurons of the hippocampus, especially the peptidergic neurotransmitters somatostatin (SS), neuropeptide Y (NPY), vasoactive intestinal peptide (VIP) and cholecystokinin (CCK). By using the content of peptidergic neurotransmitters interneurons can be sub-classified. Studies on the expression of peptidergic neurotransmitters in interneurons of primary cultures of the hippocampus are not yet available. In this work the model of hippocampal embryonic primary culture was expanded on the peptidergic neurotransmitters. The sub-regions of the dentate gyrus (G.dent) and CA3a/CA3b were cultured separately. The existing neurons were analyzed and compared in situ as in vitro for their content of peptidergic neurotransmitters like SS, NPY, CCK and VIP. In addition, the cultures were checked to see if these neurotransmitters were in colocalization with glutamate decarboxylase (GAD65), a marker of GABAergic neurons. It turns out that in the cultures the peptidergic neurotransmitters NPY, VIP, CCK, and SS are expressed. They are present. in varying degrees in the cultures of the entire hippocampus, the CA3a/CA3b and G.dent. The experiments show that, contrary to the widely accepted nature of hippocampal GABAergic interneurons, a significant proportion of NPY-, VIP- and CCK neurons are not GABAergic. In SS, there was no such deviation. Only a small percentage of NPY-positive neurons in the hippocampus- and G.dent. culture were not identified as GABAergic neurons. In the investigated VIP-and CCK-populations, non GABAergic Neurons were predominat in the hippocampus- and G.dent. culture, VIP was also present in the CA3a/CA3b-culture. Perhaps, the absence of foreign afferents from results. In kindled rats and control animals labeled NPY-positive- and SS-positive neurons were compared. With NPYergic neurons, a significant increase in the density of neurons in the CA3 region and a significant decrease in the dentate gyrus was shown. Furthermore, it was tested whether Deltamethrin application affects the culture similarly to kindled rats.In culture, the effect of different concentrations of deltamethrin was examined on the sub-populations of neurons. It was the first time that deltamethrin concentrations that are relevant to human toxicology has been used. This study showed a similar change of peptidergic interneurons under the application of deltamethrin as with kindling. The NPY expression increased massively, while SS-positive interneurons were significantly reduced. Deltamethrin application shows a significant decrease of synaptic contacts on pyramidal cells. In the concentrations used deltamethrin does not affect sodium channels. Deltamethrin leads to similar changes in the cultures, as seen in conditions of increased excitability for example in epilepsy, kindling or Kainic acid experiments. This work shows the variable expression of neurotransmitters in the development and adult state of a neuronal network and its dependency on afferents and lamina layers. It also shows how plastic the hippocampus in vivo and cultures adapt their neurotransmitter sub-sets to changing conditions of kindling and the application of deltamethrin.