Untersuchungen zur proteolytischen Aktivität pflanzlicher Milchsäfte und deren Einfluss auf die Hämostase und Fibrinolyse

Abstract

Milchsaft (Latex) ist ein komplexes Gemisch verschiedener Inhaltsstoffe, deren Funktion ungeklärt ist, aber vor allem in einem Abwehrmechanismus der Pflanze begründet wird. Proteolytische Aktivität wurde bisher in vielen Latices beschrieben, aus einigen wurden Proteasen isoliert, wobei es sich hauptsächlich um Cystein- und Serin-Proteasen handelt. Mauritanicain ist eine Serin-Protease aus dem Milchsaft von Euphorbia mauritanica L. (Euphorbiaceae), die erstmals von Dr. André Domsalla isoliert und charakterisiert wurde. In dieser Arbeit konnte Mauritanicain als Protease mit einer Molekülmasse von 73 kDa durch MALDI-TOF-MS und SDS-PAGE identifiziert werden. Möglicherweise liegt die Protease nativ als nicht kovalent verbundenes Dimer von höherer Molekülmasse vor. Der isoelektrische Punkt des Proteins liegt bei etwa 6,5. Eine optimale Umsetzung des Substrats Casein findet bei einer Temperatur von 55 - 65 °C und einem pH-Wert von 5,5 - 6,5 statt. Mauritanicain spaltet je nach Substrat bevorzugt hinter den Aminosäuren Alanin, Leucin und Lysin. Dabei scheint zunächst bevorzugt Leucin angegriffen zu werden, gefolgt von Lysin und Alanin. Dies konnte durch einen In-Gel Verdau von β-Lactoglobulin in verschiedenen Zeitintervallen festgestellt werden. Daneben findet aber auch nach weiteren Aminosäuren wie z.B. Isoleucin und Valin eine Spaltung statt. Ein mögliches pharmakologisches Einsatzgebiet von Proteasen ist die Fibrinolyse. Daher sollte Mauritanicain sowie diverse Milchsäfte auf einen Einfluss auf die Hämostase und Fibrinolyse hin untersucht werden. Plasmin ist das natürliche Enzym, welches einen Abbau von Fibrin bewirkt. Durch Screening von 122 Arten der Familie Euphorbiaceae JUSS. auf proteolytische Aktivität gegenüber dem für Plasmin spezifischen fluorogenen Substrat Boc-Val-Leu-Lys- AMC, konnte für 19 Arten eine starke Aktivität ermittelt werden, von denen 12 Arten für weitere Untersuchungen ausgewählt wurden. Eine SDS-PAGE Analyse der Latices deutet auf eine heterogene Proteinzusammensetzung mit teils partiellen Übereinstimmungen hin. Weder für diese Arten, noch für Mauritanicain war bisher ein Einfluss auf die Hämostase und Fibrinolyse beschrieben. Es wurde das Verhalten der 12 Latices und Mauritanicain in verschiedenen Methoden getestet. Thrombin führt natürlicherweise zur Gerinnung von Fibrinogen zu Fibrin. Mauritanicain sowie die Latices von Euphorbia mauritanica L. und Cnidoscolus aconitifolius (MILL.) I. M. JOHNST. führten im Fibrinogen-Platten- Test zu einer Trübung, jedoch verschwand darauffolgend, im Gegensatz zur Kontrolle, die Trübung wieder. Die fibrin(ogen)olytische Aktivität scheint bei allen zu überwiegen. So führten weder Mauritanicain noch einer der 12 Latices in einer photometrischen Untersuchung zu einer thrombinartigen und calciumunabhängigen Gerinnung. Alle Milchsäfte waren in unterschiedlichem Ausmaß in der Lage, eine Calcium-induzierte Gerinnung von Schweineplasma zu hemmen. Für Mauritanicain konnte dies bei hohen Konzentrationen oder bei einer 30 minütigen Vorinkubation ebenfalls gezeigt werden. Neben einer gewissen Fähigkeit der Latices Plasmin aus Plasminogen zu aktivieren, scheint bei ihnen und Mauritanicain der gerinnungshemmende Effekt vor allem auf eine Hydrolyse von Fibrinogen und Fibrin zurückzuführen zu sein. Neben einer fibrinolytischen Aktivität in einem Fibrin-Platten-Test konnte der Abbau von Fibrinogen und den auch damit wahrscheinlichen Abbau von Fibrin in weiteren Methoden bewiesen werden. Dies geschah durch Minderung einer Thrombin-induzierten Trübung einer Fibrinogen-Lösung, durch Fibrinogen-Zymographie und durch eine Analyse der Hydrolyse der Aα-, Bβ- und γ-Kette des Fibrinogens durch SDS-PAGE. Für Mauritanicain konnte in letzterem Verfahren ein zeitlicher Verlauf der Hydrolyse in der Reihenfolge Aα > Bβ > γ, sowie eine mögliche Herkunft der Spaltprodukte ermittelt werden. Hinter welchen Aminosäuren eine Spaltung in den drei Ketten durch Mauritanicain bevorzugt stattfindet, wurde in einem In- Gel Verdau von Fibrinogen untersucht. Letztlich konnte, bis auf für Euphorbia globosa (HAW.) SIMS, Euphorbia gregaria MARLOTH und Euphorbia schimperi C. PRESL, bei einer festgelegten Konzentration, der Abbau eines Plasma-Gerinnsels für Mauritanicain und die übrigen Latices nachgewiesen werden. Damit zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die untersuchten Latices eine Quelle für proteolytische Enzyme sind, die durch einen Abbau Fibrinogens die Hämostase negativ und u.a. durch einen Abbau eines daraus entstehenden Gerinnsels die Fibrinolyse positiv beeinflussen können und daher für weitere Untersuchungen interessant sind.

Latex is a complex mixture of various ingredients, whose function is unknown, but is mainly caused by a defense mechanism of the plant. Proteolytic activity has been described in many latices and several proteases were isolated, which are mainly cysteine and serine proteases. Mauritanicain is a serine protease from the latex of Euphorbia mauritanica L. (Euphorbiaceae), which was first isolated and characterized by Dr. André Domsalla. In this work Mauritanicain was identified as a protease with a molecular weight of 73 kDa by MALDI-TOF-MS and SDS-PAGE. It is possible that the protease is natively present as a not covalently linked dimer of a higher molecular mass. The isoelectric point of the protein is about 6.5. An optimal degradation of the substrate casein takes place at a temperature of 55 - 65 °C and pH 5.5 - 6.5. Depending on the substrate, Mauritanicain prefers cleaving behind the amino acids alanine, leucine and lysine. Initially, leucine appears to be preferentially attacked, followed by lysine and alanine, but also other amino acids such as isoleucine and valine. This could be determined by an in-gel digestion of β-lactoglobulin at different time intervals. One potential pharmacological application of proteases is fibrinolysis. Therefore Mauritanicain as well as various latices should be tested for an effect on hemostasis and fibrinolysis. Plasmin is the natural enzyme which causes degradation of fibrin. The screening of 122 species of the Euphorbiaceae JUSS. family for proteolytic activity against the specific fluorogenic substrate for plasmin Boc-Val-Leu-Lys-AMC, shows strong activity for 19 species, of which 12 species were selected for further studies. An SDS-PAGE analysis of the latices indicates a heterogeneous protein composition with partial matches. Neither for these species, nor for Mauritanicain an influence on hemostasis and fibrinolysis previously was described. The behavior of the 12 latices and Mauritanicain has been tested using different methods. Thrombin naturally induces the coagulation of fibrinogen to fibrin. In a fibrinogen-plate-assay Mauritanicain and the latices of Euphorbia mauritanica L. and Cnidoscolus aconitifolius (MILL.) I. M. JOHNST. caused clouding of the fibrinogen-agarose gel, but in contrast to the control subsequently the clouding disappeared. The fibrin(ogen)olytic activity appears to predominate for all of the latices, because in a spectrophotometric assay neither Mauritanicain nor one of the latices led to thrombin-like and calcium independent coagulation. To a variable extent all latices were able to inhibit calcium-induced coagulation of porcine plasma. For Mauritanicain this could also be shown at high concentrations or at a 30 minute pre-incubation. Apart from a certain ability of latices to activate plasmin from plasminogen, their anticoagulant effect as well as of Mauritanicain seems to be mainly the result of hydrolysis of fibrinogen and fibrin. In addition to a fibrinolytic activity in a fibrin-plate-assay, the degradation of fibrinogen and therefore also probable degradation of fibrin was proved by a reduction of thrombin-induced turbidity of a fibrinogen solution, by fibrinogen zymography and by analyzing the hydrolysis of Aα-, Bβ- and γ-chain of fibrinogen by SDS-PAGE. For Mauritanicain a time course hydrolysis in the order Aα > Bβ > γ, as well as a possible origin of the cleavage products was determined in the latter method. Behind which amino acids a cleavage in the three chains by Mauritanicain preferably takes place, has been investigated in an in-gel digestion of fibrinogen. Finally the reduction of a plasma clot could be detected at a fixed concentration for Mauritanicain and the other latices except for E. globosa (HAW.) SIMS, E. gregaria MARLOTH and E. schimperi C. PRESL. Thus the results of this work are, that the studied latices are a source of proteolytic enzymes, which can negatively affect the hemostasis due to a degradation of fibrinogen and positively affect fibrinolysis by a reduction of a resulting clot and are therefore interesting for further studies.