Entwicklung eines Krankheitsmodells für die autosomal-rezessive Osteopetrose und neuer CRISPR/Cas9-basierter gentherapeutischer Ansätze in humanen Stammzellen

Abstract

Die autosomal-rezessive Osteopetrose (ARO) ist eine schwere, erblich bedingte Knochenerkrankung, die auf den Verlust der osteoklastenvermittelten Knochenresorption zurückzuführen ist. Eine Ursache dieses Osteoklastendefekts sind Mutationen im CLCN7-Gen, das für den Cl-/H+-Austauscher ClC-7 codiert. Da Osteoklasten von hämatopoetischen Stamm- und Progenitorzellen (HSPCs) abstammen, kann ARO mittels allogener Stammzelltransplantation geheilt werden. Jedoch ist diese Therapie mit einer hohen Mortalitätsrate assoziiert und oftmals sind keine passenden Spender verfügbar. Die autologe Transplantation von mittels Genomeditierung korrigierten HSPCs könnte die Therapie der ARO verbessern. Für die Etablierung eines solchen Behandlungsansatzes wurde hier zunächst ein ARO-Krankheitsmodell entwickelt, da aufgrund der Seltenheit der Erkrankung und des jungen Alters der Patienten die HSPCs nicht in ausreichendem Maß für Forschungszwecke zur Verfügung stehen. Hierfür wurden mononukläre Zellen des peripheren Blutes eines Patienten mit CLCN7-bedingter ARO zu induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS) reprogrammiert, die anschließend zu Osteoklasten differenziert wurden. Diese waren nicht in der Lage Knochen zu resorbieren und spiegelten so den zellulären Phänotyp der Osteopetrose wider. Mithilfe dieses iPS-basierten Krankheitsmodells als auch mit HSPCs gesunder Kontrollspender wurden neue CRISPR/Cas9-basierte gentherapeutische Strategien für ARO entwickelt und getestet. Durch die Anwendung optimierter Protokolle zur CRISPR/Cas9-Genomeditierung konnten sowohl iPS als auch HSPCs selektionsfrei hocheffizient gezielt genetisch verändert werden. Darüber hinaus konnte durch die heterozygote Korrektur der pathogenen Mutation der Patienten-iPS die Knochenresorptionsfunktion der Osteoklasten partiell wiederhergestellt werden. In dieser Arbeit wurden die Grundlagen für eine somatische Gentherapie der CLCN7-bedingten ARO geschaffen, die es in Zukunft weiterzuentwickeln gilt.

Autosomal recessive osteopetrosis (ARO) is a severe hereditary bone disease caused by lacking osteoclast-mediated bone resorption. One reason for this osteoclast defect are mutations in the CLCN7 gene coding for the Cl-/H+-exchanger ClC-7. Since osteoclasts develop from hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs), allogeneic HSPC transplantation is a curative treatment for ARO. However, HSPC transplantation is associated with high mortality and often no suitable donors are available. Autologous transplantation of HSPCs corrected by genome editing could improve the treatment of ARO. Due to the rarity of the disease and the patient’s young age, HSPCs are not sufficiently available for research. Therefore, an ARO disease model was developed. Peripheral blood mononuclear cells of a patient with CLCN7-related ARO were reprogrammed into induced-pluripotent stem cells (iPSCs) and differentiated into osteoclasts. These patient osteoclasts lost their bone resorption capacity, thus recapitulating the cellular ARO phenotype. Patient-derived iPSCs and HSPCs from healthy control donors were used to develop and test novel CRISPR/Cas9-based gene therapeutic approaches for ARO. Highly efficient targeted genome editing was achieved in both iPSCs and HSPCs using optimized protocols for CRISPR/Cas9-based genome editing. Heterozygous correction of the pathogenic mutation in patient-derived iPSCs partially restored bone resorption of the iPSC-derived osteoclasts. Taken together, this work lays the foundation for a somatic gene therapy for CLCN7-related ARO, which is to be developed further in future.