Investigation of the activation mechanism of the volume-regulated anion channel VRAC and its role in cell proliferation and migration

Abstract

The volume-regulated anion channel (VRAC) is a key player in regulatory volume decrease (RVD) and has been proposed to play pivotal roles in many physiological processes. Although VRAC’s potential physiological functions and activation mechanism were studied extensively, conflicting results were obtained regarding the role of VRAC in cell proliferation and migration, as well as its activation mechanism. The lack of specific pharmacological VRAC inhibitors and the unknown molecular entity of VRAC hampered further progress aiming to elucidate its activation mechanism and proposed physiological roles. The discovery of LRRC8 heteromers as an essential component of VRAC enabled the investigation of its physiological roles and activation mechanism of VRAC using molecular biological tools. Here, I systematically examined the role of VRAC during cell growth and motility for various cell types, including C2C12 myoblasts, HCT116 cells, HEK-293 cells and U251 and U87 glioblastoma cells. Surprisingly, neither pharmacological inhibition of VRAC by carbenoxolone, 4-[(2-Butyl-6,7-dichloro-2-cyclopentyl-2,3-dihydro-1-oxo-1H-inden-5-yl)oxy]butanoic acid (DCPIB) or 5-nitro-2-(3-phenylpropyl-amino)benzoic acid (NPPB), nor siRNA-mediated knockdown or disruption of the essential VRAC subunit LRRC8A affected cell proliferation and migration in any of the investigated cell lines. I also found that inhibition of VRAC with DCPIB or siRNA against LRRC8A has no effect on PI3K/Akt signaling in glioblastoma cells. These results indicate that, contrasting the prevailing assumption in the literature, VRAC is dispensable for cell proliferation and migration. Furthermore, by using a Förster-resonance energy transfer (FRET)-based approach, I investigated the potential activation mechanism of VRAC involving protein kinase D (PKD). This revealed that both pharmacological inhibition and siRNA-mediated knockdown of PKDs impaired hypotonicity-induced VRAC activation. Hypotonicity treatment induced the formation of phosphatidic acid (PA) at the plasma membrane. These results corroborate the notion that hypotonicity-induced VRAC activation involves diacylglycerol (DAG) and PA signaling.

Der volumenregulierte Anionenkanal (VRAC) spielt eine Schlüsselrolle bei der des regulatorischen Verringerung des Zellvolumens (RVD) und soll dadurch eine Rolle bei vielen physiologischen Prozessen spielen. Obwohl die potenziellen physiologischen Funktionen und der Aktivierungsmechanismus von VRAC ausführlich untersucht wurden, wurden widersprüchliche Ergebnisse hinsichtlich der Rolle von VRAC bei der Zellproliferation und -migration sowie seines Aktivierungsmechanismus erzielt. Das Fehlen spezifischer pharmakologischer VRAC-Inhibitoren und die unbekannte molekulare Identität von VRAC behinderten weitere Fortschritte, um den Aktivierungsmechanismus und die vorgeschlagenen physiologischen Rollen aufzuklären. Die Entdeckung von LRRC8-Heteromeren als wesentlicher Bestandteil von VRAC ermöglichten, die physiologischen Rollen und den Aktivierungsmechanismus von VRAC zu untersuchen. Hier untersuchte ich systematisch die Rolle von VRAC während der Zellproliferation und der Motilität für verschiedene Zelltypen, einschließlich C2C12-Myoblasten, HCT116-Zellen, HEK-293-Zellen und U251- und U87-Glioblastomzellen. Überraschenderweise beeinflusste weder die pharmakologische Hemmung von VRAC durch Carbenoxolon, 4-[(2-Butyl-6,7-dichloro-2-cyclopentyl-2,3-dihydro-1-oxo-1H-inden-5-yl)oxy]butanoic acid (DCPIB) oder 5-nitro-2-(3-phenylpropyl-amino)benzoic acid (NPPB), noch der siRNA-vermittelte Abbau oder die Gendeletion der essentiellen VRAC-Untereinheit LRRC8A die Zellproliferation und -migration in einer der untersuchten Zelllinien. Ich fand auch, dass die Hemmung von VRAC mit DCPIB oder siRNA gegen LRRC8A keinen Einfluss auf die PI3K/Akt-Signalübertragung in Glioblastomzellen hat. Diese Ergebnisse zeigen, dass VRAC entgegen der vorherrschenden Annahme in der Literatur für die Zellproliferation und -migration entbehrlich ist. Des Weiteren habe ich unter Verwendung eines FRET-Ansatzes den Aktivierungsmechanismus des VRAC untersucht. Sowohl die pharmakologische Hemmung als auch der siRNA-vermittelte Abbau von Proteinkinasen des Typs D beeinträchtigten die durch Hypotonie induzierte VRAC-Aktivierung. Extrazelluläre Hypotonie induzierte die Bildung von Phosphatidsäure an der Plasmamembran. Diese Ergebnisse legen nahe, dass Hypotonie-induzierte VRAC-Aktivierung Diacylglycerin und Phosphatidsäure involviert.