Apoptoseinduktion in kolorektalen Zellen und Gewebe durch die HIV- Proteaseinhibitoren Saquinavir und Nelfinavir

Abstract

Einführung: Diarrhö ist eine häufige Nebenwirkung bei der Therapie der HIV- Infektion mit Proteaseinhibitoren. Bei Monolayern der Zelllinie HT-29/B6 wird durch Saquinavir und Nelfinavir die epitheliale Barrierefunktion gestört durch Induktion von Apoptose. Diese Arbeit untersucht, ob dieser Effekt zelllinienspezifisch ist, ob er bei physiologischen Konzentrationen und auch in intestinaler Mukosa und Tumorgewebe auftritt. Methoden: Die intestinalen epithelialen Zelllinien HT-29/B6, T84, LS 174T und Caco-2 wurden mit Saquinavir und Nelfinavir inkubiert. Die eingesetzten Konzentrationen der Proteaseinhibitoren entsprachen der ein- bis hundertfachen Plasmakonzentration nach oraler Aufnahme. An der Mukosa herrschen aufgrund der geringen Bioverfügbarkeit höhere Konzentrationen. In der Zellkultur wurde Apoptose mittels Durchflusszytometrie nach Propidiumjodidfärbung quantifiziert. Proben von resezierter Kolonmukosa und kolorektalen Karzinomen wurden 24 Stunden mit Nelfinavir und Saquinavir inkubiert und die Apoptoseinduktion über die Spaltung von PARP (Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase) im Western Blot quantifiziert. Eine TUNEL-Färbung wurde zur qualitativen Bestätigung eingesetzt. Als Positivkontrolle diente der Topoisomeraseinhibitor Camptothecin, der auch in Kombination mit Proteaseinhibitoren eingesetzt wurde. Ergebnisse: Alle untersuchten Zelllinien zeigten nach 24stündiger Inkubation mit 30 – 90 µM Saquinavir bzw. 35 – 140 µM Nelfinavir eine signifikante Zunahme der Apoptoserate. Der Effekt war mit der Apoptoseinduktion durch Camptothecin vergleichbar. Kombination der Proteaseinhibitoren mit Camptothecin verstärkte die Apoptoseinduktion. Apoptose durch Nelfinavir war nach 6-12 Stunden nachweisbar, durch Saquinavir nach 12-18 Stunden. In der Zellzyklusanalyse zeigte sich bei beiden Substanzen eine Zunahme der Zellfraktion in der G0/G1-Phase noch vor Beginn der Apoptoseinduktion. PARP-Spaltung wurde durch Saquinavir und Nelfinavir sowohl in normaler Mukosa als auch in Gewebe aus kolorektalen Karzinomen induziert. Nur Nelfinavir erreichte eine signifikante Steigerung der Apoptoserate in kolorektalem Karzinomgewebe. Histologisch war in Zellkultur und intestinalem Gewebe eine Zunahme apoptotischer Zellen nach Inkubation mit den Proteaseinhibitoren nachweisbar. Schlußfolgerung: Saquinavir und Nelfinavir induzieren in vitro Apoptose in unterschiedlichen intestinalen Zelllinien, sowie in Gewebeexplantaten aus kolorektaler Mukosa und Karzinomgewebe. Epitheliale Apoptose kann in vivo zu einer gestörten Barrierefunktion mit Leckfluss-Diarrhö führen. Die Apoptoseinduktion durch Saquinavir und Nelfinavir könnte von Nutzen sein für die antineoplastische Therapie kolorektaler Karzinome.

Introduction: Diarrhea is a frequent adverse event in treatment of HIV infection with protease inhibitors. In HT-29/B6 cell monolayer saquinavir and nelfinavir disturb epithelial barrier function through induction of apoptosis. This dissertation investigated whether this effect is cell line specific, whether physiologic concentrations are effective and whether it occurs as well in explanted colorectal mucosa and tissue of colorectal carcinomas. Methods: Intestinal epithelial cell lines HT-29/B6, T84, LS 174T and Caco-2 were incubated with saquinavir and nelfinavir. Concentrations of protease inhibitors were one to one hundred times the concentrations found in plasma after oral intake. At mucosal level higher concentrations are found due to low bioavailability of protease inhibitors. Apoptosis in treated cell lines was quantified by flow cytometry following propidium iodide staining. Samples of explanted colorectal mucosa and carcinomas were incubated 24 hours with nelfinavir and saquinavir and induction of apoptosis was measured by quantification of PARP (Poly-(ADP-Ribose)-Polymerase) cleavage by western blot. TUNEL staining was used for qualitative confirmation. Camptothecin, an inhibitor of topoisomerase and known inductor of apoptosis, served as positive control and was also used in combination with protease inhibitors. Results: In all tested cell lines apoptotic rate increased significantly after incubation with 30 – 90 µM saquinavir and 35 – 140 µM nelfinavir. This effect was comparable to incubation with camptothecin. Nelfinavir induced apoptosis after 6 – 12 hours, Saquinavir after 12 – 18 hours. Analysing influences on the cell cycle, both substances showed an elevation of the proportion of cells in the G0/G1-phase of cell cycle before an increased apoptotic rate was demonstrable. PARP cleavage by Saquinavir and Nelfinavir was detected in normal mucosa and in tissue of colorectal carcinomas, but only Nelfinavir had a significant effect in colorectal carcinoma tissue. An increase of apoptotic cells could be demonstrated by TUNEL staining in cell culture and in tissue culture after incubation with protease inhibitors. Conclusion: In vitro, saquinavir and nelfinavir induce apoptosis in different intestinal cell lines, in explanted colorectal mucosa and tissue of colorectal carcinomas. In vivo, epithelial apoptosis can result in barrier dysfunction leading to diarrhea by a leak flux mechanism. Induction of apoptosis by Saquinavir and Nelfinavir could be useful in antineoplastic therapy of colorectal cancer.