Analyse der Effekte der MEK1S212N-Mutation hinsichtlich Signaltransduktion und Phänotyp in Rattenfibroblasten und HEK293-Zellen

Abstract

Der MAPK-Signalweg ist einer der zentralen Forschungsschwerpunkte in der aktuellen Krebsforschung. Etwa 30 % der Krebserkrankungen (Nandan und Yang 2011; Hoshino et al. 1999) lassen sich auf Mutationen in diesem Signalweg zurückführen. Darunter befindet sich auch die Gruppe der kolorektalen Karzinome, die die dritthäufigste Ursache für vorzeitige Todesfälle durch Tumoren in Deutschland ausmachen (Robert Koch-Institut 2019). MEK-Proteine nehmen eine zentrale Stellung innerhalb des MAPK-Signalwegs zwischen Raf und ERK ein. Mutationen in MEK1 können so z. B. die Proliferation einer Zelle stark beeinflussen (Jindal et al. 2017). In der Kolonkarzinomzelllinie LIM1215 ist bei einer Panel-DNA-Sequenzierung die MEK1S212N-Mutation gefunden worden. Diese Zelllinie ist aus dem HNPCC eines Patienten mit Lynch-Syndrom generiert worden. Ziel dieser Arbeit ist es, festzustellen, ob die Mutation eine funktionelle Rolle im Darmkrebs spielt. Dafür soll geklärt werden, ob eine Expression von MEK1(S212N) in vitro in den eigens dafür eingesetzten Zellsystemen zu einer Steigerung von phosphoryliertem ERK1/2 führt und damit eine konstitutiv aktive Form des MEK1 darstellt. Weiterhin sollen im murinen 208F-Zellsystem eventuelle Änderungen der Zellmorphologie in Abhängigkeit der Expression von MEK1(S212N) detektiert werden. Es sind verschiedene MEK1-Konstrukte generiert und in Trägerplasmide kloniert worden, um mittels lentiviraler Partikel die Zelllinien Hek293 und 208F stabil zu transduzieren. Anschließend sind mittels Western Blot und Mikroskopie die Auswirkungen von MEK1S212N auf die biochemischen und morphologischen Eigenschaften der Zellen analysiert worden. Die in der vorliegenden Arbeit vorgestellten Daten belegen, dass die MEK1S212N-Mutation in einzelnen Karzinomen nachgewiesen werden kann. Es ist außerdem gelungen, mit den genannten Methoden stabile transgene Zellen herzustellen, die das MEK1-Konstrukt ausreichend stark überexprimierten. Jedoch ist mit den gewählten Methoden keine Veränderung der Signalwegaktivität oder Veränderung der Zellmorphologie durch eine Expression dieser Mutation nachgewiesen worden. Die funktionelle Relevanz für die betroffenen Zellen und das Gewebe bleibt unklar.

The MAPK signaling pathway is a major focus of current cancer research. About 30 % of all cancers show activating mutations in the MAPK signaling pathway (Nandan and Yang 2011, Hoshino et al. 1999). A major example of tumors in which MAPK pathway mutations are important is colorectal cancer (CRC). CRC is the third most common cause of death by cancer in Germany (Robert Koch-Institute 2019). The MEK isoforms play a central role between ERK and Raf in the MAPK signaling pathway. Mutations in the MEK1 gene have been shown to alter the proliferation of cell (Jindal et al. 2017). By genome panel sequencing it was found that a colorectal cancer cell line harbours a MEK1S212N mutation. This cell line was derived from a hereditary non-polyposis colorectal cancer (HNPCC) of a patient who suffered from Lynch syndrome. The aim of the present thesis was to characterize the hitherto uncharacterized MEK1S212N mutation in order to assess if it may be implicated in the development of CRC. The central questions were if mutations of MEK1 are present in tumors, and if the expression of MEK1S212N in vitro leads to increased activation of the downstream protein, ERK1/2. To address this question, the MEK1 gene of a cohort of carcinomas was sequenced. Furthermore, different constructs of MEK1 mutants were generated and cloned into lentiviral plasmids. These transgenes were then introduced in Hek293 and 208F cells, and the effect of the synthesis of mutant MEK1 proteins was subsequently investigated using biochemical and morphological methods. The data presented in this thesis shows that MEK1S212N was detected in a few carcinomas. Furthermore, it was possible to generate stable transgene cell lines that significantly express the MEK constructs. However, with the methods used in this thesis, no change in the activity of the signaling pathway and no change of the cell morphology due to the expression of MEK1S212N could be detected. With these results, the functional relevance for affected cells and tissues remains unclear.