Exploration of the 1,3-dipolar cycloaddition reaction between azide and phosphorane partners and use in peptide ligation

Abstract

Our aim was to integrate triazole ligation into standard Fmoc-based peptide synthesis and develop a biocompatible triazole ligation. For this purpose phophorane chemistry which has already been integrated into solid phase peptide synthesis by our group for C-terminal variation of peptides, was used for the synthesis of peptidyl-phosphoranes. The dissertation deals with use of peptidyl-phosphoranes as a dipole in 1,3-dipolar cycloaddition reaction with azides. Polymer-supported triphenylphosphane was alkylated with tert-butyl bromoacetate and resulting phophoranylidene acetate was acylated with activated amino acid through racemization-free C-acylation and the peptide chain was elongated through Fmoc-based solid phase peptide synthesis (SPPS). After N-acetylation of the amine terminus of the peptide chain or coupling azido acid at the N-terminus, the tert-butyl ester was saponified with TFA. Ester cleavage proceeded with instantaneous decarboxylation resulting in peptidyl phosphoranes or azido-peptidyl phosphoranes depending on N-terminus of peptide chain. Peptidyl phosphoranes were first reacted with electron deficient azides such as triflic azide, tosyl azide, 4-nitro benzoyl azide and 4-carboxyl phenyl azide in unpolar solvents at room temperature with complete regioselectivity in favor of 1,5-disubstituted triazole. The reaction, however, needed polar solvents and gentle heating in case of relatively electron rich azides such as benzyl azide, methyl 2-azido acetate and 2-azido- acetamide but still with good yield and complete regioselectivity. Finally, this reaction was used for short peptides ligation by heating peptidyl phosphoranes with azido peptides in polar solvents like THF and DMF. The potential of ligation products, with 1,5-triazole incorporated, to form stable conformations in solution was investigated using 2D-ROESY spectroscopy and molecular dynamic simulations. All the structures consistently indicated a turn-like bent in short peptides. Azido-peptidyl phosphoranes were subjected to cyclative-cleavage resulting in triazolyl-cyclopeptides. When azido- dipeptidyl phosphoranes were heated in DMF, they delivered exclusively dimeric products. In contrast to this, the azido-tripeptidyl phosphoranes yielded a mixture of monomeric and dimeric triazolyl-cyclopeptides through competition between intra-versus inter-site reactions. To minimize inter-site reactions by using a more rigid resin with higher percentage of cross linker, macroporous polystyrene resin (20% divinyl benzene) was used instead of microporous polystyrene (2% polystyrene) and a major shift towards monomeric product (intra-site reaction) in case of azido-tripeptidyl phosphorane was observed. Azido-dipeptidyl phopsphoranes, however, still resulted in the formation of dimeric products (inter-site reaction) despite of using the macroporous resin. This observation indicates that azido dipeptides are too short to be cyclized through cyclative cleavage and inter-site cyclization is strongly favored in this case. As expected, azido-tetra-, penta- and octa-peptidyl phosphoranes resulted in monomeric triazolyl-cyclopeptides. The solid phase chemistry described above was translated into solution phase to broaden its applications in chemical biology through a flexible scheme allowing variation of substituents on phosphorous centre. Wang resin was esterified with bromoacetyl bromide which was then used for alkylation of trivalent phosphane. Peptide chain was then constructed on support bound phosphoranylidene acetate. Finally, soluble peptidyl-phosphorane was released into solution by treatment with TFA and then used in solution phase triazole ligation. Thus, the triazole ligation method established has potential to introduce β-turn in short peptide chains. Moreover, the reaction is devoid of any metal catalysis and has potential to be developed as biocompatible ligation. In this context soluble peptidyl phosphoranes were synthesized and used in azide-phosphorane triazole ligation in aqueous medium at room temperature. The peptide cyclization method through triazole ligation completely avoids formation of soluble, non cyclized and oligomeric by-products and is superior to solution phase cyclizations. The method provides an easy access to cyclopeptides with locked cis-peptide mimetic.

Ziel dieses arbeit war der Integration der Triazolligation in die Fmoc- basierte Peptidsynthese und die Entwicklung einer biokompatiblen Triazolliagtion. Zu diesem Zweck wurden polymergebundene Phosphorane, die bereits in der Festphasenpeptidsynthese für C-terminale Variationen von Peptiden in unserer Gruppe angewandt worden ist, für die Synthese von Peptidylphosphoranen verwendet. In dieser Dissertation ist die Anwendung der Peptidylphosphorane als Dipol bei 1,3-dipolaren Cycloadditionen mit Aziden beschrieben. Polymer-unterstütztes Phosphoranylidenacetat wurde durch Alkylierung mit tert-Butyl-essigester und anschließender Deprotonierung mit Triethylamin erhalten. Das festphasen-gebundene Wittigylid wurde für eine razemisierungsfreie C-C Acylierung und eine weitere Festphasenpeptidsynthese (SPPS) erfolgreich verwendet. Nach Acetylierung oder Einführung einer Azido- gruppe am N-Terminus wurde die tert-Butyl-Schutzgruppe mit TFA abgespalten. Nach der Esterabspaltung und anschließender Decarboxylierung wurden.Peptidylphosphorane oder Azidophosphorane erhalten Das Peptidylphosphoran wurde mit elektronenarmen Aziden wie Trifluoroacetylazid, Tosylazid, 4-Nitrobenzylazid und Carboxylphenylazid in unpolaren Lösungsmitteln bei Raumtemperatur regioselektiv zu 1,5-disubstituierten Triazolen umgesetzt. Bei elektronenreichen Aziden wie Benzylazid, Methyl-2-azidoacetat und 2-Azidoacetamid konnten 1,5-disubstituierte Triazole synthetisiert werden, allerdings unter Anwendung von polaren Lösungsmitteln bei 60°C. Letztendlich wurde diese Reaktion für kurze Peptidligationen durch Erhitzen von Peptidylphosphoranen mit Azidopeptiden in polaren Lösungsmitteln wie THF oder DMF verwendet. Das Potential der Ligationsprodukte mit eingebauten 1,5-Triazolen stabile Konformationen in Lösung zu bilden wurde unter Anwendung der 2D-ROESY-Spektroscopie und die Molekulare Dynamische Simulation untersucht. Die Azido-Peptidyl-Phosphorane wurden durch die cyclische Spaltung zu Tirazolyl-zyklopeptiden umgesetzt. Wenn Azido-dipeptidyl Phosphorane in DMF erhitzt werden, reagieren sie zu Dimeren. Im Gegensatz dazu, durch die Konkurenz zwischen intra-gegen inter-zentrenreaktionen, die Azido-tripeptidyl phophorane führten zu einer Mischung aus monomeren und dimeren Triazolyl-zyklopeptiden. Ein rigideres macroporöses Harz mit höherer prozentualer Quervernetzung (20% DVB) wurde hier anstatt der bis jetzt benutzten mikroporöser Harz verwendet, um die interzentrenreaktionen zu vermeiden und eine höher Verschiebung der Reaktion Richtung des monomeren Produktes im Falle des Azido-tripeptidylphosphorans. Azido- dipeptidylphosphorane wurden unter Anwendung des makroporösen Harz in der dimeren Form erhalten. Unsere Beobachtungen zeigen, dass Azido-dipeptide zu kurz für eine zyklische Abspaltung sind. In diesem Fall ist außerdem die interzentrenreaktion streng bevorzugt. Azido tetra-, penta- und octa-peptidyl- phosphorane wurden wie erwartet als monomere Triazolyl-zyklopeptide erhalten. Die oben beschriebene Festphasensynthese wurde auch in Lösung durchgeführt, um die breite Anwendung der Methode in der chemischen Biologie und die Variation der Substituenten in relevanten Positionen zu zeigen. Das Wang Harz wurde mit Bromacetylbromid verestert, welches dann für die Alkylierung des dreiwertigen Phosphans.verwendet wurde Das peptidische Teil wurde am festphasengebundenen Phosphoranylidenacetat synthetisiert. Letztendlich wurden lösliche Peptidylphosphorane in Lösung gebracht unter Behandlung mit TFA und wurden in Lösung für die Triazolligation verwendet. Demzufolge hat die establierte Triazolligationmethode hat das Potential, die β-Turns in kurze Peptideketten einzubringen. Ein weiterer Vorteil dieser Methode ist, dass ohne Metallkatalyse gearbeitet werden kann. In diesem Zusammenhang wurden lösliche Peptidylphosphorane synthetisiert und in das Azido-phosphoran Triazolligation in wässrigem Medium bei Raumtemperatur eine Anwendung gefunden haben. Die Zyklisierungsmethode durch die Triazolligation vermeidet Komplett die Bildung von löslichen nicht zyklisierten und oligomeren Nebenprodukten und ist sehr gut geeignet für Zyklisierungen in Lösung. Die Methode bietet einen einfachen Zugang zu zyklischen Peptiden mit formschlüssigen cis-Peptidmimetika.