Präklinische ex vivo-Effekte von CFTR-Modulatoren an humanen Rektumbiopsien zur Medikamentenentwicklung bei Mukoviszidose

Abstract

Mukoviszidose (CF) ist eine hereditäre Multiorganerkrankung, die durch einen Funktionsverlust eines Chlorid-Kanals (cystic fibrosis transmambrane conductance regulator, CFTR) an der apikalen Membran sekretorischer Zellen entsteht. Hauptmanifestationen sind eine chronisch-entzündliche Lungenerkrankung und eine exokrine Pankreasinsuffizienz. CFTR-Modulatoren sollen die Funktion des CFTR-Proteins steigern. Die Bewertung neuer Modulatoren präklinisch und klinisch gestaltet sich bisweilen jedoch aufgrund unzureichender Modelle sowie Outcome-Parameter schwierig. Die Intestinale Kurzschlussstrommessung (ICM) als CFTR-Biomarker wurde bisher zur Untersuchung des Basisdefektes und bei schwieriger Diagnosestellung herangezogen. Zunächst sollten die Eigenschaften des Biomarkers hinsichtlich intraindividueller Variabilität und Reproduzierbarkeit überprüft werden, um den Einsatz der ICM in klinischen Studien zu etablieren. Außerdem sollte der ex vivo-Effekt verschiedener CFTR-Modulatoren bestimmt werden, um die Möglichkeiten der präklinischen Modulatoruntersuchung mittels ICM zu überprüfen. Zwischen Oktober 2011 und März 2013 wurden insgesamt 508 Rektumschleimhautbiopsien von 50 Probanden untersucht (14 gesunde Nichtraucher, 27 PI-CF, 9 PS-CF). Davon erhielten 8 Probanden (3 non-CF, 2 PI-CF, 3 PS-CF) wiederholte ICM-Messungen nach 0, 7 und 14 Tagen. Nach Etablierung der Reliabilität wurden alle Biopsien je nach Genotyp mit Ivacaftor (30 µM), Lumacaftor (10/30 µM), Ataluren (10 µM), Gentamicin (400 mg/ml), Hylout4 (100 µM), EPIX4 (10 µM), EPIX5 (10 µM), EPIX6 (10 µM) oder Kombinationen sowie DMSO 0,1 % über 16h inkubiert (37°C, 96 % O2, 5 % CO2). Im Anschluss wurde erneut die CFTR-Funktion mittels ICM bestimmt. Die intraindividuelle Variabilität der ICM fiel gering aus, 87 % der Messungen erfüllten das Kriterium für Reproduzierbarkeit. Lumacaftor zeigte einen Trend zur Verbesse-rung der CFTR-Funktion bei F508del homozygoten Patienten um 10,9 %, die Kombination aus Ivacaftor und Lumacaftor führte in dieser Patientengruppe zu keiner Steigerung der CFTR-Funktion. Ataluren sowie EPIX4, EPIX5 und EPIX6 bewirkten keine Verbesserung der CFTR-Funktion. In der Patientengruppe mit einer Klasse IV- oder V-Mutation zeigte sich die Mutation R347P responsiv für Ivacaftor, die Mutationen 3849+10kbC->T, A455E, 2789+5G->A oder L206W zeigten dagegen keine Responsivität. Hylout4 führte bei CF-Patienten mit einer Klasse IV- oder V-Mutation zu einer nicht signifikanten Verbesserung der CFTR-Funktion um 26 %. Diese Daten deuten den möglichen Nutzen der ICM an einerseits zum Einsatz in klinischen Studien insbesondere in frühen Phasen oder bei kleiner Studienpopulation, um die Wirksamkeit von CFTR-Modulatoren zu demonstrieren, sowie andererseits zur präklinischen Evaluation der mutationsspezifischen oder individuellen Wirksamkeit dieser vielversprechenden Medikamentengruppe. Es sind weitere Daten zur Korrelation von Verbesserung der CFTR-Funktion in der ICM und klinischem Outcome erforderlich, um den Einsatz der ICM in der Entwicklung neuer CFTR-Modulatoren voranzutreiben.

Cystic fibrosis (CF) is a hereditary multi-organ disease caused by a loss of function in a chloride channel (CFTR) at the apical membrane of secretoric cells. Main manifestations are chronic inflammatory lung disease and exocrine pancreatic insufficiency. CFTR modulators are developed to increase CFTR function. Still a lack of optimal models and outcome parameters complicates the preclinical and clinical evaluation of new modulators. Intestinal current measurement (ICM) as CFTR biomarker has served to investigate the basic defect and as a diagnostic tool. We investigated the characteristics of ICM concerning intraindividual variability and reproducibility as a basis for the use of ICM in clinical studies. Then the ex vivo effect of various CFTR modulators was determined to estimate the possibilities of CFTR modulator testing at a preclinical stage. Between October 2011 and March 2013 a total of 508 rectum suction biopsies from 50 probands were investigated (14 healthy non-smokers, 27 PI-CF, 9 PS-CF). 8 specimens (3 non-CF, 2 PI-CF, 3 PS-CF) underwent 3 repetitive ICM measurements every 7 days. After establishment of the reliability of the method, all biopsies were incubated according to their genotype for 16h (37°C, 96 % O2, 5 % CO2) with Ivacaftor (30 μM), Lumacaftor (10/30 μM), Ataluren (10 μM), Gentamicin (400 mg/ml), Hylout4 (100 μM), EPIX4 (10 μM), EPIX5 (10 μM), EPIX6 (10 μM) or combinations as well as DMSO 0,1%. Afterwards CFTR function was determined again by ICM. Intraindividual variability of ICM was low, 87 % of measurements fulfilled the criteria for reproducibility. Lumacaftor increased CFTR function in F508del homozygous patients by 10.9 %, combination of Ivacaftor and Lumacaftor did not show an improvement of CFTR function. Ataluren, EPIX4, EPIX5 and EPIX6 did not increase CFTR function. In the group with a class IV or V mutation, the variant R347P appeared responsive to Ivacaftor, whereas the mutations 3849+10kbC->T, A455E, 2789+5G->A or L206W did not. Hylout4 increased CFTR function statistically not significant by 26 % in CF patients with a class IV or V mutation. These data suggest the benefit of ICM for the use in clinical trials especially in early phases or with small study populations to determine the efficacy of CFTR modulators and for preclinical evaluation of mutation-specific or individual efficacy of this promising group of drugs. More data are needed about correlation of improvement of CFTR function in ICM and clinical outcome to promote the use of ICM in CFTR modulator development.