Untersuchungen zur Struktur und Funktion der class C Vps Tethering-Komplexe HOPS und CORVET

Abstract

In eukaryotischen Zellen werden einzelne Kompartimente mittels vesikulären Transportes verknüpft. Tethering dient dabei als Bindeglied zwischen Transport /Adres-sierung und Fusion mit der Zielmembran. Die Class C Vps Tethering- Komplexe HOPS und CORVET erfüllen diese Aufgabe im endolysosomalen Transportweg. Auch wenn die Funktion der Komplexe gut untersucht ist, so ist unser Wissen um die molekularen Grundlagen der Funktionsweise dieser Komplexe noch lückenhaft. Struktur-Funktions-Analysen können einen Einblick in diese Grundlagen gewähren. Für fünf der sechs Untereinheiten von HOPS wurden zueinander stark ähnliche Domänenarchitekturen vorhergesagt, was jüngst für den C-terminalen Bereich belegt werden konnte. In der vorliegenden Arbeit konnte nun erstmalig durch Kristallisation des N-terminus von Vps18 bestätigt werden, dass die Vorhersage der N-terminalen Domäne als β-Propeller korrekt ist. Das im Kristall als Dimer vorliegende Protein zeigt einen typischen siebenblättrigen β-Propeller mit einem Velcro-Verschluss. Die einzel¬nen Moleküle sind dabei zueinander um 180° gedreht und durch eine C2-Symmetrie verknüpft. Die Kontaktfläche des Dimers ist durch elektrostatische Interaktionen geprägt, jedoch ist die physiologische Relevanz der Interaktionsfläche und der beteiligten Aminosäuren trotz zum Teil hoher Konservierung fragwürdig. Vorhersagen und experimentellen Daten nach handelt es sich aller Wahrscheinlichkeit nach um Kristall-kontakte. Am Rand des Propellers, genauer zwischen Blatt 2 und Blatt 3, konnte eine auffällige Schleifenstruktur identifiziert werden, welche eine zwischen Spezies konser- vier¬te Sequenz Lx[KR][WFLI]K (in Hefe LNKIK) aufweist. Durch Lipid-Co- Sedimentationsexperimente sowie gezielte Mutagenese konnte gezeigt werden, dass die beiden Lysine dieser Sequenz entscheidend für die Membranbindung sind. Somit konnte in dieser Arbeit erstmalig dem N-terminalen Bereich eine Funktion außerhalb des Komplexaufbaus zugewiesen werden, sowie eine neue Klasse von Membran-bindenden β-Propellern, neben den bekannten PROPPINs, identifiziert werden. Die bekannte Beteiligung an der Stabilisierung des HOPS- Komplexes konnte im Rahmen von in vitro-Experimenten genauer eingegrenzt werden. Diese zeigten eine direkte Interaktion des N-terminalen Propellers von Vps18 mit der N-terminalen Domäne von Vps11. Die N-terminale Domäne von Vps11 weist zwar weder eine Lx[KR][WFLI]K-Sequenz noch ein PROPPIN-Motiv auf, dennoch konnte eine Membranaffinität festgestellt werden. Aufgrund des Fehlens einer Kristallstruktur konnte der interagierende Bereich jedoch nicht durch gezielte Mutagenese-Studien ermittelt werden. Der genaue Bindungsmechanismus bleibt somit für Vps11, im Gegensatz zu Vps18, im Unklaren.

In eukaryotic cells, individual compartments are connected via the vesicular transport pathway. Tethering acts as the bridging step between transport/addressing of vesicles and their fusion with target membranes. The class C Vps tethering complexes HOPS and CORVET are acting on the endolysomal transport pathway. Although their cellular function is well understood, little is known about the molecular mechanisms. Structure-function analysis can be of great help to further our molecular understanding of these tethering mechanisms. Five of the six known subunits of HOPS share similar predicted domain architectures. At least for the C-terminal domain, this prediction was recently confirmed by protein crystallography. In the present study, the N-terminal domain of the HOPS subunit Vps18 was crystallized. The resulting structure is that of a typical seven-bladed β-propeller, with a velcro closure, thus confirming the initial structure prediction. In the asymmetric unit of the crystal, a dimer of two molecules is observed, related to each other by a 180° rotation and C2 symmetry. The interface is defined by electrostatic interactions. Although several of the interacting residues show high levels of conserva-tion, experimental data and predictions indicate that the interaction is not likely to be of relevance for the biological function of Vps18. At the rim of the propeller, more specifically between blade 2 and blade 3, an extended loop containing a conserved Lx[KR][WFLI]K (in yeast LNKIK) sequence can be found. Relying on lipid co-sedimentation assays and mutagenesis, it could be shown that this sequence is responsible for interactions of the propeller with lipid membranes. Thus for the first time, a functional role of the N-terminal domain could be determined, apart from its known function in stabilizing the complex. Moreover, the Vps18 β-propeller constitutes a novel class of membrane-binding propellers, complementing the known PROPPINs. Besides this, the known function of stabilizing the HOPS complex could be further specified by showing that the Vps18 propeller can interact directly with the N-terminal domain of Vps11. Although Vps11 shows neither a Lx[KR][WFLI]K sequence nor a PROPPIN motif, membrane-binding properties were also found for this N terminal domain. Due to the lack of a known structure, no further analysis of this property was possible. Therefore, and different from the Vps18 propeller, the lipid-binding mechanism of Vps11 remains unknown.