Epidemiology of Ticks and Tick-borne Pathogens in the Semi-arid and the Arid Agro-ecological Zones in Pakistan

Abstract

Ticks and tick-borne diseases have a large impact on animal health and the livelihood of livestock owners, particularly in developing countries. Despite the suitability of Pakistan’s climate for ticks, there is a paucity of systematic work investigating these parasites and the diseases, which they transmit in this country. To better understand the distribution of ticks, the whole country was divided into five agro-ecological zones using Global-Aridity dataset and 108 livestock farms from 9 different districts, covering the semi- arid and the arid agro-ecological zones in Punjab province, were included in the study. Ticks were collected from two randomly selected animals of each ruminant species present at the farm (194 buffaloes, 179 cattle, 80 goats and 18 sheep) and stored in 70% ethanol. Morphological identification of the ticks was subsequently performed using standard taxonomic keys and multikey software, a computer-based polychotomous key. The identification was confirmed by sequencing of a partial fragment from the second internal transcribed spacer (ITS2) and cytochrome oxidase subunit 1 (cox1) genes from randomly selected specimens of each species which proved that the morphological and molecular data are coherent in the identification of the 4 tick species. The prevalence of ticks between the agro-ecological zones was significantly different (P = 0.037). There was no farm found without ticks. In total, 3,807 (12 larvae, 1,231 nymphs, 1,303 females and 1,261 males) ixodid ticks representing four different species were collected: Hyalomma anatolicum (n = 3,021, 79.3%), Rhipicephalus microplus (n = 715, 18.8%), Hyalomma dromedarii (n = 41, 1.0%), and Rhipicephalus turanicus (n = 30, 0.9%). Rh. microplus was the predominant species in the semi-arid zone, whereas Hy. anatolicum was the most abundant tick species in the arid zone. Hy. dromedarii and Rh. turanicus were found only in the arid zone. In all the districts, multiple tick species were found except Multan district, where only Hy. anatolicum was present. The overall proportion of tick-infested ruminants was 78.3% (369/471), and was significantly different (P < 0.001, χ² = 126.9) among animal species. It was highest in cattle (89.9%), followed by buffaloes (81.4%), goats (60%) and sheep (11.1%). The median tick burdens recorded (43 ticks per animal, ranged from 27-67) were significantly different among the animal species (P < 0.001) and were highest in cattle (median = 58), followed by buffaloes (median = 38), goats (median = 19) and sheep (median = 4.5). In large ruminants, older animals carried more ticks than younger animals (buffalo, P = 0.020; cattle, P = 0.002). It was observed that female animals had higher tick burdens than male animals (buffalo, P = 0.002; cattle, P < 0.001; goat, P = 0.014; sheep, P = 0.02). The intensity of infestation was significantly lower in indigenous animals as compared to exotic (P < 0.001) and crossbred cows (P < 0.001), while the difference was not statistically significant between crossbred and exotic cattle (P = 0.11). The majority of the animals were infested with a single tick species (90.5%), while only a few were infested with multiple species (9.5%). After identification, the ticks were divided into 405 (Hy. anatolicum = 300, Rh. microplus = 89, Hy. dromerdarii = 9, Rh. turanicus = 7) tick pools (semi-arid zone = 113, arid zone = 292) and screened by RLB assay for the presence of DNA of 41 tick-borne pathogens, i.e. Anaplasma, Ehrlichia, Babesia, Theileria and Rickettsia species. Out of total 405 tick pools, DNA from at least one tick-borne pathogen was found in 148 (36.5%) pools. Among the positive pools, 94 (63.5%) had a mixed infection with two or more (ranging from 2 to 5) tick-borne pathogen species with 18 different combinations, whereas 54 (36.5%) pools were infected with single tick-borne pathogen species. The overall prevalence estimates of tick-borne pathogens in Punjab were significantly different (χ² = 90.2, df = 3, P < 0.001), and the prevalence of Ehrlichia spp. (22.2%) was highest, followed by Theileria (9.9%), Anaplasma (7.7%) and Babesia spp. (2.5%). 11 species of Rickettsiales, namely: A. centrale, A. marginale, A. ovis, Anaplasma sp. BL099-6, Ehrlichia sp. (Multan), Ehrlichia sp. ERm58, Ehrlichia sp. Firat, E. mineirensis, Ehrlichia sp. Omatjenne, R. massiliae and R. raoultii, were identified in four tick species (Hy. anatolicum, Hy. dromedarii, Rh. microplus and Rh. turanicus) from two agro-ecological zones in Punjab through genetic analyses of 16S rRNA. Moreover, four Babesia species (B. bigemina, B. bovis, B. caballi, and B. occultans) and three Theileria species (T. annulata, T. ovis, and T. orientalis) were also detected in Hy. anatolicum and Rh. microplus ticks. The most common tick-borne pathogen was a hitherto uncharacterized species, i.e. Ehrlichia sp. (Multan) (18.0%, CI 14.4-22.1), and 16S rRNA gene sequences showed 99% identity to previously described Ehrlichia species. Other common tick-borne pathogens were Ehrlichia sp. ERm58 (16.3%, CI 22.8-20.3), Ehrlichia sp. Firat (16.0%, CI 12.6-20), Theileria annulata (6.7%, CI 4.4-9.6), Anaplasma marginale (5.7%, CI 3.6-8.4), T. orientalis (buffeli) (3.5%, CI 1.9-5.7), E. mineirensis (3.2%, CI 1.7-5.4) and A. centrale (2.7%, CI 1.4-4.8). This study represents the first evidence of the occurrence of Anaplasma sp. BL099-6, Ehrlichia sp. (Multan), Ehrlichia sp. ERm58, Ehrlichia sp. Firat, E. mineirensis, Ehrlichia sp. Omatjenne, R. massiliae, R. raoultii, B. occultans and T. orientalis in Pakistan. Moreover, we report the first detection of A. marginale, E. mineirensis and Ehrlichia sp. Omatjenne in Hy. anatolicum and R. raoultii in Rh. microplus ticks. Our data showed that Hyalomma and Rhipicephalus ticks in Punjab were naturally infected with Rickettsiales, Babesia and Theileria species. Analysis of questionnaire data using univariable and multivariable logistic regression analysis revealed that the absence of rural poultry on farm (P = 0.005, OR = 4.4), not using any acaricides (P < 0.001, OR = 7.5), traditional rural housing system (P = 0.007, OR = 13.1) and grazing (P = 0.003, OR = 12.6) were potential risk factors associated with a higher tick prevalence on livestock farms. Attachment site preferences significantly varied by animal species for Hy. anatolicum (χ² = 140.4, P < 0.001) and Rh. microplus (χ² = 77.6, P < 0.001). It can be concluded that a much broader spectrum of ticks and tick-borne pathogens is present in Pakistan than previously thought, including several potential zoonotic pathogens. In addition, a novel Ehrlichia species with 99% sequence identity to the taxon described previously, was identified. It is expected that the outcomes of this study will be useful in the planning of integrated control strategies for ticks and tick-borne diseases in Pakistan.

Zecken und durch Zecken übertragene Krankheiten haben einen großen Einfluss auf die Tiergesundheit und den Lebensunterhalt der Halter von Nutztieren, besonders in Entwicklungsländern. Das Klima Pakistans ist ideal für Zecken, dennoch mangelt es an systematischen Studien, die sich mit diesen Parasiten und den von ihnen in diesem Land übertragenen Krankheiten beschäftigen. Um die Verbreitung der Zecken besser zu verstehen, wurde das Land mit Hilfe von Global-Aridity Daten in fünf agrarökologische Zonen unterteilt. Daten von 108 landwirtschaftlichen Betrieben aus 9 Bezirken sind in diese Studie eingeflossen, womit die ariden und semiariden agrarökologischen Zonen der Provinz Punjab abgedeckt werden. Zecken wurden in jedem Betrieb von zwei zufällig ausgewählten Tieren jeder vorkommenden Wiederkäuerart gesammelt (194 Wasserbüffel, 179 Rinder, 80 Ziegen und 18 Schafe) und in 70% Ethanol gelagert. Die morphologische Bestimmung der Zecken erfolgte mit taxonomischen Standardschlüsseln und Multikey Software, einem computerbasierten polychotomen Schlüssel. Diese Bestimmung wurde bestätigt durch Sequenzierung eines Teilfragments des zweiten Internal Transcribed Spacers (ITS2) und der Untereinheit 1 des Cytochromoxidase (cox1) Gens von zufällig gewählten Individuen jeder Art, was die Übereinstimmung morphologischer und molekularer Daten für die Bestimmung der vier gefundenen Zeckenarten bestätigt. Die Verbreitung der Zecken in den verschiedenen agrarökologischen Zonen war signifikant verschieden (P = 0,037). Es gab keinen Betrieb ohne Zecken. Insgesamt wurden 3.807 Schildzecken (12 Larven, 1231 Nymphen, 1303 Weibchen und 1261 Männchen) aus vier Arten gesammelt: Hyalomma anatolicum (n = 3021; 79,3 %), Rhipicephalus microplus (n = 715; 18,8%), Hyalomma dromedarii (n = 41; 1,0%) und Rhipicephalus turanicus (n = 30; 0,9 %). R. microplus war die häufigste Art in der semiariden Zone, während Hy. anatolicum die häufigste Zecke der ariden Zone war. Hy. dromedarii und Rh. turanicus wurden nur in der ariden Zone gefunden. In allen Bezirken wurden mehrere Arten gefunden, außer in Multan, wo es nur Hy. anatolicum gab. Der Gesamtanteil der mit Zecken befallenen Tiere betrug 78,3 % (369/471) und war signifikant verschieden (P < 0,001; χ² = 126,9) unter den Tierarten. Am größten war der Anteil bei Rindern (89,9%), gefolgt von Wasserbüffeln (81,4%), Ziegen (60%) und Schafen (11,1%). Der mittlere Zeckenbefall, 43 Zecken pro Tier, von 27 bis 67 reichend, war signifikant verschieden (P < 0,001) unter den Tierarten und zwar am höchsten bei Rindern (58), gefolgt von Wasserbüffeln (38), Ziegen (19) und Schafen (4,5). Bei den großen Wiederkäuern hatten alte Tiere mehr Zecken als jüngere (Wasserbüffel P = 0,02; Rind P = 0,002). Es wurde ferner beobachtet, dass Weibchen mehr Zecken hatten als Männchen (Wasserbüffel P = 0,002; Rind P < 0,001; Ziege P = 0,014; Schaf P = 0,02). Die Befallsintensität war signifikant niedriger bei einheimischen Tieren als bei exotischen (P = 0,001) und Kreuzungsrassen (P = 0,001), aber der Unterschied zwischen exotischen und Kreuzungen war nicht signifikant (P = 0,11). Die Mehrzahl der Tiere war nur mit einer Zeckenart befallen (90,5%) und nur wenige mit mehreren Zeckenarten (9,5%). Nach der Bestimmung wurden die Zecken in 405 (Hy. anatolicum = 300; Rh. microplus = 89; Hy. dromedarii = 9; Rh. turanicus = 7) Pools unterteilt (semiaride Zone = 113; aride Zone = 292) und mittels RLB auf die Präsenz von 41 Pathogenen untersucht, d.h. Anaplasma, Ehrlichia, Babesia, Theileria und Rickettsia - Arten. In 148 von 405 Pools (36,5%) wurde DNA von mindestens einem Pathogen gefunden. Von diesen positiven Pools hatten 94 eine Mischinfektion von zwei bis fünf Pathogenen in 18 Kombinationen, während 54 (36,5%) nur mit einem Pathogen infiziert waren. Die geschätzte Prävalenz der von Zecken übertragenen Pathogene in Punjab war signifikant verschieden (χ² = 90.2, df = 3, P < 0.001) und die Prävalenz von Ehrlichia spp. (22,5%) war am höchsten, gefolgt von Theileria spp. (9,9%), Anaplasma spp. (7,7%) und Babesia spp. (2,5%). Obwohl es nicht statistisch signifikant sein mag, lag der höchste Anteil infizierter Zecken bei Hy. anatolicum vor (37,3%), gefolgt von R. microplus (34,8%), Rh. turanicus (28,6%) und Hy. dromedarii (22,2%). Neun Arten der Rickettsiales, im einzelnen A. centrale, A. marginale, A. ovis, Anaplasma sp. BL099-6, Ehrlichia sp. (Multan), Ehrlichia sp. ERm58, Ehrlichia sp. Firat, E. mineirensis, Ehrlichia sp. Omatjenne, R. massiliae, R. raoultii wurden in den vier Zeckenarten aus zwei agrarökologischen Zonen in Punjab mittels 16S rRNA Analyse identifiziert. Weiterhin wurden vier Babesia Arten (B. bigemina, B. bovis, B. caballi, and B. occultans) und drei Theileria Arten (T. annulata, T. ovis, and T. orientalis) in Hy. anatolicum und Rh. microplus Zecken gefunden. Das häufigste von Zecken übertragene Pathogen war eine bisher unbeschriebene Art, nämlich Ehrlicha sp. (Multan) (18,0%, CI 14,4-22,1) und 16S rRNA Gensequenzen zeigten 99% Übereinstimmung zu bisher beschriebenen Ehrlichia Arten. Andere verbreitete Pathogene waren Ehrlichia sp. ERm58 (16,3%, CI 22,8-20,3), Ehrlichia sp. Firat (16%, CI 12,6-20), Theileria annulata (6,7%, CI 4,4-9,6), Anaplasma marginale (5,7%, CI 3,6-8,4), T. orientalis (buffeli) (3,5%, CI 1,9-5,7), E. mineirensis (3,2%, CI 1,7-5,4) and A. centrale (2,7%, CI 1,4-4, 8). Diese Studie ist der erste Nachweis von Anaplasma sp. BL099-6, Ehrlichia sp. (Multan), Ehrlichia sp. ERm58, Ehrlichia sp. Firat, E. mineirensis, Ehrlichia sp. Omatjenne, R. massiliae, R. raoultii, B. occultans and T. orientalis in Pakistan. Weiterhin ist es der erste Nachweis von A. marginale, E. mineirensis and Ehrlichia sp. Omatjenne in Hy. anatolicum and R. raoultii in Rh. microplus - Zecken. Unsere Daten zeigen, dass Hyalomma und Rhipicephalus Zecken in Pakistan auf natürliche Weise mit Rickettsiales, Babesia and Theileria - Arten infiziert sind. Umfrageanalysen mittels univariabler und multivariabler logistischer Regessionsanalyse zeigten, dass die Abwesenheit von Geflügel auf den landwirtschaftlichen Betrieben (P = 0,005; OR = 4,4), das Nichtverwenden von Akariziden (P < 0,001; OR = 7,5), die traditionelle Bauweise (P = 0,007; OR = 13,1) und Weidehaltung (P = 0,003; OR = 12,6) potenzielle Risikofaktoren sind, die im Zusammenhang mit einem hohen Zeckenvorkommen auf den Betrieben stehen. Die Stellen, an denen sich die Zecken vorzugsweise anhefteten, unterschieden sich je nach Tierart für Hy. anatolicum (χ² = 140,4; P < 0,001) and Rh. microplus (χ² = 77,6; P < 0,001). Schlussfolgernd kann man sagen, dass das Spektrum an Zeckenarten und Pathogenen in Pakistan größer ist als bisher angenommen und einige mögliche zoonotische Pathogene enthält. Außerdem konnte eine neue Ehrlichia-Art mit 99% Sequenzübereinstimmung zur Gattung identifiziert werden. Es ist zu erwarten, dass die Ergebnisse dieser Studie für die Planung ganzheitlicher Strategien zur Bekämpfung von Zecken und durch Zecken übertragener Krankheiten in Pakistan nützlich sein werden.