dc.contributor.author
Margittai, Martin
dc.date.accessioned
2018-06-07T16:45:39Z
dc.date.available
2002-06-11T00:00:00.649Z
dc.identifier.uri
https://refubium.fu-berlin.de/handle/fub188/2999
dc.identifier.uri
http://dx.doi.org/10.17169/refubium-7199
dc.description
Title and Contents
1 Introduction 1
2 Materials and Methods 15
3 Results 27
4 Discussion 65
5 Summary 79
6 Zusammenfassung 81
7 References 83
8 Appendix 96
dc.description.abstract
SNARE proteins are thought to be key mediators of all intracellular fusion
reactions ranging from yeast to man. The assembly of ternary SNARE complexes
between the synaptic vesicle-protein synaptobrevin and the plasma membrane
proteins syntaxin and SNAP-25 initiates membrane fusion at the nerve terminal.
The interaction between SNARE proteins is mediated by a stretch of
approximately 60 amino acids referred to as the SNARE motif. The crystal
structure of the synaptic SNARE complex revealed an extended four helix bundle
with all helices aligned in parallel (two from SNAP-25, one from syntaxin, and
one from synaptobrevin). Syntaxin contains an additional independently folded
domain known as the Habc domain. An intramolecular interaction between this
domain and the SNARE motif arrests syntaxin in a closed conformation. Only
when there is no interaction between the two domains (open conformation) does
the SNARE complex assemble. In this study, the conformational switching of
syntaxin and the structures of SNARE intermediates and fully assembled SNARE
complexes are investigated. Fluorescence anisotropy measurements reveal that
the Habc domain slows down SNARE complex formation by a factor of 5-7,
implying a weak interaction between the Habc domain and the SNARE motif (ΔG ≈1
kcal/mol) . The intramolecular distances between the two domains were measured
by single molecule fluorescence resonance energy transfer. Only 15-30% of all
syntaxin molecules are in a closed conformation. Conformational fluctuations
between the open and closed states occur in a time range of ~0.7 ms. In order
to arrest syntaxin in a closed conformation an additional protein (munc-18) is
required. Binary complexes between syntaxin and SNAP-25 (2:1 stoichiometry)
are potential intermediates in SNARE complex assembly. Electron paramagnetic
resonance data indicate that the binary complex is composed of a bundle of
four Α-helices with the syntaxin helices being in register. Furthermore,
binary complexes are loosely structured at the very N-and C-terminal ends of
syntaxin and the C-terminal ends of both SNAP-25 helices. Binding of
synaptobrevin displaces one of the syntaxin molecules and thus completes SNARE
complex formation. Assembly of binary and ternary complexes from individual
SNAREs is accompanied by large structural changes. Isolated synaptobrevin and
SNAP-25 are unstructured. Syntaxin, too, is unstructured but oligomerizes at
higher µM concentrations. Oligomerization is mediated by the SNARE motif of
syntaxin and may compete with intramolecular binding of the Habc domain. To
find out whether helices in the SNARE complex require juxtaposing helices, a
C-terminally truncated synaptobrevin was used. Helices remain completely
intact upstream from the truncated site; helices downstream from the truncated
site collapse. Interacting layers in the four-helix bundle of SNARE complexes
therefore appear to be independent from layers in nearby positions. This
agrees with the proposed "zippering mechanism" of complex formation and
provides a structural basis according to which partially assembled complexes
form intermediates in the progression toward membrane fusion. To test whether
SNARE proteins interact via their transmembrane regions syntaxin and
synaptobrevin were studied in proteoliposomes. Syntaxin formed specific dimers
that might be precursors in binary complex formation. In addition a new
interaction between the transmembrane domains of syntaxin and synaptobrevin
was observed which might be important for a late stage in membrane fusion. An
extension of the four-helix bundle into the transmembrane region might
contribute to the formation of membrane continuity between proximal leaflets
of the fusing membranes. In conclusion, syntaxin participates in many
molecular interactions and undergoes multiple conformational transitions until
it is bound in a fully assembled SNARE complex.
de
dc.description.abstract
SNARE Proteine spielen eine wichtige Rolle in allen intrazellulären
Fusionsreaktionen von der Hefe bis zum Menschen. Es wird vermutet, daß die
Bildung von ternären SNARE Komplexen zwischen dem synaptischen Vesikelprotein
Synaptobrevin und den Plasmamembranproteinen Syntaxin und SNAP-25 zur
Membranfusion in der Nervenendigung führt. Die Interaktion zwischen SNARE
Proteinen erfolgt über einen 60 Aminosäuren umfassenden Abschnitt, dem SNARE
Motiv. Die Kristallstruktur des synaptischen SNARE Komplexes ergab ein
langgestrecktes Vierhelixbündel, in dem alle Helizes parallel angeordnet sind
(zwei SNAP-25 Helizes und je eine Syntaxin und eine Synaptobrevin Helix).
Syntaxin besitzt eine zusätzliche, unabhängig gefaltete Domäne, die Habc
Domäne. Eine intramolekulare Interaktion zwischen der Habc Domäne und dem
SNARE Motiv arretiert Syntaxin in einer geschlossenen Konformation. Nur wenn
es keine Interaktion zwischen diesen Domänen gibt (offene Konformation) kann
sich der SNARE Komplex ausbilden. In dieser Arbeit wurden der konformationelle
Schaltmechanismus Syntaxins und die Strukturen von SNARE Intermediaten und
vollständig ausgebildeten SNARE Komplexen untersucht. Fluoreszenz Anisotropie
Untersuchungen ergaben, daß die Habc Domäne die SNARE Komplexbildung um das
fünf bis siebenfache verlangsamt. Dies spricht für eine schwache Interaktion
zwischen der Habc Domäne und dem SNARE Motiv (ΔG ≈ 1 kcal/mol). Die
intramolekularen Abstände zwischen diesen Domänen wurden durch
Einzelmolekülfluoreszenz Resonanz Energietransfermessungen bestimmt. Nur
15-30% aller Syntaxin Moleküle sind geschlossen. Konformationelle
Fluktuationen zwischen den offenen und geschlossenen Zuständen erfolgen in
einem Zeitraum von ~0.7 ms. Um Syntaxin in eine geschlossene Konformation zu
drängen, wird ein zusätzliches Protein (Munc-18) benötigt. Binäre Komplexe
zwischen Syntaxin und SNAP-25 (2:1 Stöchiometrie) sind potentielle
Intermediate in der Ausbildung von SNARE Komplexen. Elektronen paramagnetische
Resonanz Daten ergaben, daß der binäre Komplex ein Vierhelixbündel ist, in dem
die beiden Syntaxinhelizes parallel angeordnet sind. Die N- und C-termini
Syntaxins und die C-termini beider SNAP-25 Helizes sind in diesem Komplex
unstrukturiert. Die Bindung Synaptobrevins führt zu einer Verdrängung eines
Syntaxinmoleküls und damit zur Bildung eines ternären Komplexes. Bei der
Bildung binärer und ternärer Komplexe aus individuellen SNAREs erfolgen große
strukturelle Veränderungen. Synaptobrevin und SNAP-25 sind alleine völlig
unstrukturiert. Syntaxin ist auch unstrukturiert, oligomerisiert aber bei
höheren mikromolekularen Konzentrationen. Die Oligomerisierung wird vom SNARE
Motiv vermittelt und kann mit einer intramolekularen Interaktion mit der Habc
Domäne konkurrieren. Um herauszufinden, ob die Struktur von einzelnen Helizes
im SNARE Komplex von dem Vorhandensein gegenüberliegender Helizes abhängt,
wurde ein C-terminal verkürztes Synaptobrevin eingesetzt. N-terminal von der
Verkürzung waren die Komplexe strukturell intakt, wohingegen C-terminale
Helizes, kollabierten. Die Interaktionsebenen im Vierhelixbündel von SNARE
Komplexen scheinen somit unabhängig von benachbarten Ebenen zu sein. Dieser
Befund stimmt mit dem vorgeschlagenen "Reissverschlussprinzip der
Komplexbildung" überein und liefert eine strukturelle Basis für die Ausbildung
von SNARE Komplex Intermediaten im Verlauf der Membranfusion. Um zu prüfen, ob
SNARE Proteine über ihre Transmembrandomänen interagieren und somit die SNARE
Komplexbildung beeinflussen, wurden die Interaktionen zwischen Syntaxin und
Synaptobrevin in Proteoliposomen untersucht. Syntaxin bildete spezifische
Dimere die Vorläufer von binären Komplexen sein könnten. Zusätzlich wurde eine
neue Interaktion zwischen den Transmembranregionen von Syntaxin und
Synaptobrevin beobachtet, die wichtig für eine späte Phase der Fusion sein
könnte. Eine Verlängerung des Vierhelixbündels bis in die Membranregion könnte
zur Ausbildung eines Membrankontinuums zwischen proximalen Schichten
fusionierender Membranen sorgen. Syntaxin ist an vielen molekularen
Interaktionen beteiligt und durchläuft multiple Konformationsänderungen bevor
es im vollständig ausgebildeten SNARE Komplex gebunden ist.
de
dc.rights.uri
http://www.fu-berlin.de/sites/refubium/rechtliches/Nutzungsbedingungen
dc.subject
syntaxin SNARE fluorescence EPR fusion
dc.subject.ddc
500 Naturwissenschaften und Mathematik::570 Biowissenschaften; Biologie::570 Biowissenschaften; Biologie
dc.title
Structure and Dynamics of Neuronal SNARE Complex Assembly Studied by Electron
Paramagnetic Resonance- and Fluorescence Spectroscopy
dc.contributor.firstReferee
Prof. Dr. Reinhard Jahn
dc.contributor.furtherReferee
Prof. Dr. Ferdinand Hucho
dc.date.accepted
2001-10-31
dc.date.embargoEnd
2002-06-13
dc.identifier.urn
urn:nbn:de:kobv:188-2002000961
dc.title.subtitle
Break off and Resumption of Diplomatic Relations 1965 - 1972
dc.title.translated
Struktur und Dynamik der synaptischen SNARE-Komplexbildung: Eine Fluoreszenz-
und Elektronen-Spin-Resonanz-Studie
de
dc.title.translatedsubtitle
Abbruch und Wiederaufnahme der diplomatischen Beziehungen 1965 bis 1972
de
refubium.affiliation
Biologie, Chemie, Pharmazie
de
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FUDISS_thesis_000000000596
refubium.mycore.transfer
http://www.diss.fu-berlin.de/2002/96/
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FUDISS_derivate_000000000596
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open access