Untersuchungen zu den Glycolipiden von Borrelia burgdorferi, dem Erreger der Lyme-Borreliose, und deren Verwendung in der Serodiagnostik sowie als Impfstoff

Abstract

Lyme-Borreliose (LB) ist eine Infektionskrankheit, deren Erreger einige Bakterienarten aus der taxonomischen Gruppe Borrelia burgdorferi sensu lato ("im weiteren Sinn") sind. Die Diagnose erfolgt aufgrund der klinischen Manifestationen und einer bestätigenden Serologie. Die Serodiagnostik und die Impfstoffentwicklung werden durch die Heterogenität der Proteinantigene zwischen und teilweise innerhalb der Bakterienarten vor große Herausforderungen gestellt. Ein Impfstoff gegen LB ist weder aktuell verfügbar, noch in Aussicht.

Das Ziel dieser Arbeit war es, die Glycolipide von B. burgdorferi sensu lato eingehend zu analysieren und auf ihre Einsetzbarkeit für beide medizinischen Anwendungen hin zu untersuchen. Es wird dargelegt, dass die verschiedenen Arten unabhängig von ihrer Pathogenität die gleichen Glycolipide aufweisen und diese etwa 13 % der Borrelientrockenmasse ausmachen. Die Glycolipide der drei klinisch wichtigsten Pathogene wurden isoliert, chromatographisch aufgereinigt, quantifiziert und chemisch mittels GLC/MS, NMR und MALDI-TOF analysiert. Die dominierende Struktur ist Cholesteryl-6-O-acyl-β-D-galactopyranosid (ACGal), das fast die Hälfte der Glycolipide und damit 5-6 % des Borreliengewichtes ausmacht. Jeweils etwa ein Viertel stellen Cholesteryl-β-D-galactopyranosid (CGal) sowie Mono-α-D-galactosyldiacylglycerol (MGalD) und ein kleiner Anteil ist Cholesteryl-β-D-glucopyranosid (CGlc). Sowohl ACGal als auch CGal sind innerhalb von Bakterien und Tieren einmalige Strukturen. Experimente mit Zellkulturen zeigten, dass keines der Glycolipide von den Toll-like-Rezeptoren des angeborenen Immunsystems erkannt wird. Eine Untersuchung der Gesamtlipide mit LB-Patientenseren identifizierte dagegen ACGal und MGalD als Antigene des erworbenen Immunsystems. Die Analyse dieser beiden isolierten Antigene mit 174 LB-Patientenseren mittels Dot-Blots oder Line-Blots ergab, dass im Spätstadium der LB 83 % bzw. 63 % der Seren Antikörper gegen ACGal mit Titern bis 1:32.000 aufwiesen. Der eng verwandte Erreger des Rückfallfiebers, Borrelia hermsii, verfügt dagegen statt ACGal über Cholesteryl-6-O-acyl-β-D-glucopyranosid, das von LB-Seren nicht erkannt wird. Ebenso ist die Spezifität von ACGal bei oft kreuzreagierenden Seren anderer Erkrankungen sehr gut. ACGal kann daher zusätzlich zu den Proteinantigenen zur Verbesserung von kommerziellen Borrelien-Serodiagnostik-Kits eingesetzt werden und wird von einer Firma bereits verwendet.

Um die Eignung von ACGal als Impfstoff zu untersuchen, wurde ein effizienter chemisch-enzymatischer Syntheseweg konzipiert und erprobt. Dabei wurde CGal zunächst mittels der Trichloracetimidatmethode dargestellt und dann mittels einer Lipase regioselektiv zum ACGal acyliert. Diese Vorgehensweise wurde zum Aufbau einer Glycolipidbibliothek mit diversen ACGal-Derivaten verwendet, die zur Bestimmung des Epitops der Anti-ACGal-Antikörper in den LB-Patientenseren diente. Die Kenntnis des antigenen Epitops ermöglichte wiederum die Synthese eines funktionalisierten ACGal. Für den dabei verwendeten ω-Mercaptoacyl-Rest wurde eine einfache Schützung und Entschützung mit der flüchtigen Thioethylgruppe etabliert. Zur Konjugation des hydrophoben, funktionalisierten ACGal an hydrophile Trägerproteine wurde eine neue Methode entwickelt, die reproduzierbar hohe Beladungsgrade erzielt. Mit diesen immunogenen ACGal- Konjugaten wurden Kaninchen erfolgreich immunisiert und die generierten Antikörper mittels Immunoblots charakterisiert. Die bestimmten Antikörpertiter unterschieden sich zwischen den ACGal-Derivaten und erreichen Werte von 1:128.000 für natives ACGal und 1:512.000 für kurzkettige, artifizielle ACGal- Derivate, wobei das Epitop mit dem der humanen Antikörper übereinstimmt. Mittels Immunofluoreszenz wurde gezeigt, dass die Antiseren an intakte Borrelien binden und das Epitop somit für Antikörper zugänglich scheint. Nicht mehr untersucht wurde, ob die Antikörper die Borrelien opsonieren oder sogar abtöten können. In noch ausstehenden Tierversuchen muss geklärt werden, ob eine Impfung mit ACGal-Konjugat vor einer Infektion mit B. burgdorferi schützen kann.

Lyme Disease (LD) is an infectious disease caused by several bacterial species of the taxonomic group of Borrelia burgdorferi sensu lato ("in a wider sense"). The diagnosis is based on clinical manifestations and confirmed by serology. However, serodiagnostics as well as the development of a vaccine are hampered by the heterogeneity of the protein antigens between or even within the bacterial species. A vaccine is neither available today nor foreseeable.

The aim of this work was to analyze and evaluate the glycolipids of B. burgdorferi sensu lato for both medical applications. It is shown that different species possess identical glycolipids independent of their pathogenicity accounting for approx. 13 % of the cellular dry weight. The glycolipids of the clinically most relevant species were isolated, separated by column chromatography, quantified and analyzed by GLC/MS, NMR, and MALDI- TOF. The dominant structure is cholesteryl-6-O-acyl-β-D-galactopyranoside (ACGal) representing nearly half of the glycolipids and therefore 5-6 % of the borrelial mass. About one quarter of the glycolipids are composed of cholesteryl-β-D-galactopyranoside (CGal) and mono-α-D-galactosyldiacylglycerol (MGalD), and a minor proportion constitutes cholesteryl-β-D-glucopyranoside (CGlc). ACGal as well as CGal are unique structures within the bacteria and the animal kingdom. Experiments with cell cultures revealed that none of the glycolipids is recognized by toll-like receptors of the innate immune system. However, screening of the total lipids with LD patient sera identified ACGal and MGalD as antigens of the adaptive immune system. Subsequent analyzes of both antigens with 174 LD patient sera using dot-blots or line-blots demonstrated the highest seroprevalence in the late stage of disease. Then 83, and 63 % respectively of the sera contained antibodies against ACGal with titers up to 1:32,000. On the other hand the closely related causative agent of tick-borne relapsing fever, Borrelia hermsii, instead of ACGal contains cholesteryl-6-O-acyl-β-D-glucopyranoside that is not recognized by LD sera. Also, the specificity of ACGal for cross-reacting sera of patients with other diseases is excellent. Taken together, ACGal can be employed in addition to proteinacious antigens to improve commercial Borrelia serodiagnostics kits and one company is currently pursuing this.

To assess the use of ACGal as a vaccine, an efficient chemo-enzymatic synthesis route was established. First, CGal was prepared by the trichloroacetimidate method. Next it was acylated regioselectively to ACGal by lipase. This approach was utilized to build a glycolipid library consisting of diverse ACGal derivatives to determine the epitope of the anti-ACGal antibodies in LD patient sera. Knowledge of the antigenic epitope enabled the synthesis of a functionalized ACGal molecule. For the employed ω-mercaptoacyl residue a simple protection and deprotection strategy was developed using the evaporable thioethyl protecting group. This allows the conjugation of ACGal to immunogenic carrier proteins. To achieve high conjugation grades in a reproducible fashion a new method was designed to bring these hydrophobic and hydrophilic molecules into reaction. These ACGal conjugates were used to successfully immunize rabbits. The antibodies generated were characterized by different immunoblotting methods. The determined antibody titers varied between the ACGal derivatives and reached values of 1:128,000 for native ACGal and 1:512,000 for artificial short-chain ACGal derivatives. However, the epitope coincided with the one detected by human antibodies. Applying immunofluorescence it could be shown that the antisera bound to whole Borrelia and that the epitope seems to be accessible to the antibodies. It was not examined whether antibodies opsonize Borrelia or are capable of killing them. Furthermore, it remains to be investigated in animal experiments whether a vaccination with an ACGal conjugate is able to prevent an infection by B. burgdorferi.