Bestimmung der Wirtstierarten in Blutmahlzeiten von Tsetsefliegen (Diptera: Glossinidae) mittels der Polymerasekettenreaktion und Restriktionsfragment- Längenpolymorphismus- Analyse (PCR-RFLP)

Abstract

Tsetsefliegen sind obligat blutsaugende Arthropoden, die ausschließlich an Wirbeltieren Blut saugen. Sie sind für die Übertragung der Schlafkrankheit beim Menschen und der afrikanischen Trypanosomosen bei Haustieren in weiten Teilen Afrikas südlich der Sahara (Tsetsegürtel) verantwortlich. Kenntnisse über das Verhalten von Tsetsefliegen bei der Nahrungsaufnahme sind erforderlich, um die Beziehung zwischen Wirt und Vektor und ihre jeweilige Rolle im Übertragungszyklus der Krankheit zu verstehen. Die Herkunft der Blutmahlzeiten der Tsetsefliegen liefert dabei wichtige Informationen über die natürlichen Ernährungsgewohnheiten der verschiedenen Fliegenarten aus der Gattung Glossina. Ziel der Arbeit war es daher, ein DNA-analytisches Untersuchungsverfahren zur Tierartidentifikation des von Tsetsefliegen aufgenommenen Blutes zu entwickeln. Es wurde eine DNA-Bank von Haus- und Wildtierarten eingerichtet, die 33 potenzielle Wirbeltierwirte von Tsetsefliegen erfasst. Die DNA wurde aus natürlichen Proben, wie Blut, Haaren und Haut extrahiert und mittels PCR unter Verwendung universeller Cytochrom b-Primer (cytb 1 und cytb 2) amplifiziert. Die verwendeten Primer waren komplementär zu konservierten Regionen des Cytochrom b - Gens der Wirbeltiere und führten bei allen untersuchten Arten der Familie Bovidae zu übereinstimmenden aber variablen 359 bp PCR-Produkten. Die Auswahl geeigneter Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen basierte auf dem Vergleich von mtDNA Sequenzdaten von Boviden, die vom "National Centre for Biotechnology Information� (USA) bezogen wurden. Die potenziellen Schnittstellen innerhalb der verschiedenen 359 bp Amplifikate, wurden mit dem von der �New England Biolab Incorporation� entwickelten frei verfügbaren Programms �NEB cutter V1.0� identifiziert. Für die Unterscheidung der verschiedenen Arten der Familie Bovidae wurde unter Nutzung der unterschiedlichen Restriktionsenzyme TaqI, AluI, HindII die PCR-RFLP Analyse verwendet. Die erhaltenen artspezifischen Restriktionsprofile waren für die Identifikation von allen 10 untersuchten Bovidenarten geeignet. Die Interpretation der Restriktionsprofile erfolgte visuell, durch Vergleich mit Referenzproben und unter Verwendung eines 50 bp DNA-Markers. Eine Computeranalyse war nicht notwendig. Die Ergebnisse zeigen, dass es unter Verwendung universeller cytb Primer möglich ist, die in der Blutmahlzeit von Tsetsefliegen vorhandene Wirtstier-DNA zu amplifizieren. Die Nachweisrate in Blutmahlzeiten von Tsetsefliegen mittels PCR-RFLP betrug 24 h nach der Blutaufnahme 100%, nach 48 h 80%, nach 72 h 60% und nach 96 h 40%. Außerdem war die Technik auch für die Amplifikation der DNA von Blutausstrichen auf Filterpapier geeignet. Bei Verwendung antiseptischer Lösungen wurde die Wirtstier- DNA nicht zerstört. Nach der Verdauung der PCR Amplifikate mit Restriktionsendonukleasen entstanden durch co-Amplifikation nukleärer cytb Pseudogene einige unspezifische DNA Fragmente. Außerdem wurde bei einigen Tierarten eine unvollständige Restriktionsverdauung beobachtet. Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass die cytb PCR-RFLPAnalyse eine vielversprechende Methode für die Identifikation der Blutmahlzeiten von Tsetsefliegen ist.

Tsetse flies are obligatory haematophagous arthropods, feeding only on vertebrate blood. They are responsible for the transmission of Human Sleeping Sickness (HSS) and African Animal Trypanosomosis (AAT) in large areas of sub- Saharan Africa. Information on the feeding behaviour of tsetse is essential in understanding the relationship between hosts and vectors, and their respective roles in a disease transmission cycle. The source of a tsetse bloodmeal might provide important information relating to the epidemiology of trypanosomosis and natural feeding habits of different species of Glossina. The aim of this work was to develop a DNA based assay for the identification of bloodmeals from tsetse flies. A DNA bank from potential vertebrate hosts of tsetse flies was established comprising of 33 wild and domestic vertebrate species. DNA was extracted from biological specimens, such as blood, hair and skin and submitted to PCR using universal Cytochrome b primers (cytb 1 and cytb 2). The primers were complementary to the conserved region of the cytochrome b gene of vertebrates leading to a consistent but variable 359 bp-PCR products in all bovid species tested. The selection of appropriate restriction endonucleases sites was based on the comparison of mtDNA sequence data of bovids drawn from the search tool of the National Centre for Biotechnology Information (USA). Sites for all restriction enzymes that cut the amplified 359 bp sequence were identified by means of the free available programme NEB cutter V1.0 designed by New England Biolab Incorporation. PCR-RFLP analysis was used to differentiate different species of the family Bovidae by using different restriction endonucleases; TaqI, AluI and HindII. The obtained species- specific restriction profiles were suitable for the identification of 10 bovid species tested in this study. Interpretation of the restriction profiles was performed visually by comparison with reference samples and help of 50 bp molecular size marker, without the need for computer analysis. The results also demonstrate that it is possible to use universal cytb primers to amplify DNA present in bloodmeals from haematophagous tsetse (Diptera: Glossinidae). The detection rate of host DNA in tsetse bloodmeals by PCR-RFLP was 100%, 80%, 60% and 40% at 24, 48, 72 and 96 h post-feeding, respectively. In addition, the technique was successfully used to amplify DNA from blood smeared onto filter paper and subjected to antiseptic solutions without deterioration in the host DNA. After digestion of PCR amplicons with restriction endonucleases, some non-specific DNA fragments were obtained in some species due to co- amplification of nuclear cytb pseudogenes. In addition, incomplete digestion was observed in some species. The results of this study reveal that the cytb PCR-RFLP analysis is a promising tool for the identification of tsetse bloodmeals.