Ursprung und Expansion der Klonalen Hämatopoese während der hämatopoetischen Differenzierung

Abstract

Introduction: Clonal haematopoiesis of indeterminate potential (CHIP) is a phenomenon whose frequency rises with age. It is associated with the risk of hematologic neoplasia, cardiovascular events and shorter OS. It is defined by the presence of somatic mutations with a variant allele frequency (VAF) ≥2 % in the peripheral blood of individuals without a hematologic disease or morphologic abnormalities. Our objective was to identify the cell-of-origin and to describe the clonal expansion pattern of mutations during hematopoietic differentiation. Additionally, we resolved to analyze associations with clinical parameters and to evaluate the dynamics of CHIP-mutations under cellular stress conditions such as radiochemotherapy. Methods: 437 patients (n = 365 and n = 72) were recruited within the main project. For mutation detection, we used a combination of targeted deep and digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) sequencing. Flow cytometry was used to separate different PB and bone marrow cell fractions. In side projects, we studied the role of CHIP during hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) and the clinical significance of EGR2 mutations in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Results: 168 mutations could be detected in 121 patients (CHIP prevalence 27.7 %). The mutation burden in the different haematopoietic cell fractions of the PB was quantified in 91 individuals. We analyzed the mutations in stem and progenitor cells of the BM in nine patients. All mutations present in the PB could already be detected in the Lin-CD34+CD38- haematopoietic stem cells. The strongest expansion arose mostly during the earlier stages of hematopoietic differentiation within the stem cell compartment. The mutations predominantly expanded towards myeloid rather than lymphatic cell fractions. Almost exclusively, the VAFs in the myeloid cell fractions and in the natural killer cells were greater than in the lymphatic T and B cells (P = .0001). The presence of two or more mutations was highly significantly associated with peripheral arterial occlusive disease (P = .001) and significantly associated with diabetes mellitus type 2 (P = .034). CHIP-positive patients undergoing cytostatic chemotherapy showed variations in therapy tolerance, side effects and dynamics of the various CHIP clones. Despite differences in the clinical course, HSCT from CHIP-positive donors seems to lead to similar results regarding the OS as HSCT from CHIP-negative donors. Conclusion: These findings provide new insight into the ontogenesis and expansion of CHIP and enhance our understanding of the clinical associations and their relevance during chemotherapy and HSCT.

Die Klonale Hämatopoese von unbestimmtem Potential (CHIP) ist ein mit dem Alter in der Häufigkeit zunehmendes Phänomen. Sie ist mit dem Risiko der Entstehung hämatologischer Neoplasien, kardiovaskulärer Ereignisse und einem kürzeren Gesamtüberleben (OS) assoziiert. Definiert wird sie durch das Vorkommen somatischer Mutationen mit einer Varianten Allelfrequenz (VAF) ≥2 % im peripheren Blut (PB) von Individuen ohne eine nachgewiesene hämatologische Erkrankung oder morphologische Veränderungen der Blutzellen. Ziel der Arbeit war die Identifizierung der Ursprungszelle und die Beschreibung des klonalen Expansionsmusters der Mutationen während der hämatopoetischen Differenzierung. Auch sollten Assoziationen mit klinischen Parametern und die Dynamik der Mutationen unter zellulären Stressbedingungen einer Radiochemotherapie analysiert werden. Methodik: Im Hauptprojekt wurden insgesamt 437 Patienten (n = 365 und n = 72) rekrutiert. Zum Mutationsnachweis wurde die gezielte Tiefensequenzierung verwendet. Mittels Durchflusszytometrie wurden verschiedene Zellreihen des PB und des Knochenmarks (KM) aufgetrennt. In Nebenprojekten wurde sowohl die Rolle von CHIP während einer allogenen Stammzelltransplantation (HSCT) als auch die klinische Bedeutung von EGR2-Mutationen bei Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) untersucht. Ergebnisse: Insgesamt konnten 168 Mutationen in 121 Patienten (CHIP-Prävalenz 27,7 %) nachgewiesen werden. In 91 Individuen wurde die Mutationslast in den einzelnen hämatopoetischen Zellfraktionen des PB quantifiziert. In neun Patienten wurden die Mutationen darüber hinaus in den Stamm- und Vorläuferzellen des KM untersucht. Die im PB auftretenden Mutationen konnten dabei in allen untersuchten Fällen bereits in den Lin-CD34+CD38- hämatopoetischen Stammzellen nachgewiesen werden. Zur größten relativen Expansion der Mutationslast kam es meist während der früheren Stadien der hämatopoetischen Differenzierung innerhalb des Stammzell-Kompartiments. Die Mutationen expandierten zumeist stärker in myeloische als in lymphatische Zellfraktionen. Im PB waren die VAFs in der myeloischen Zellreihe und in den natürlichen Killerzellen in fast allen Fällen hochsignifikant größer als in den lymphatischen T- und B-Zellen (P = .0001). Darüber hinaus war der Nachweis von zwei oder mehr Mutationen hochsignifikant mit dem Auftreten einer peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (P = .001) und signifikant mit dem eines Diabetes mellitus Typ 2 (P =.034) assoziiert. CHIP-positive Patienten zeigten unter zytostatischer Chemotherapie Abweichungen in Bezug auf Therapieverträglichkeit, Nebenwirkungen und die Dynamik der unterschiedlichen CHIP-Klone. Die HSCT von CHIP-positiven Spendern scheint trotz Unterschieden im klinischen Verlauf zu ähnlichen Ergebnissen bezüglich des OS zu führen wie eine HSCT mit CHIP-negativen Spendern. Schlussfolgerung: Die Ergebnisse liefern erstmalig einen Einblick in die Ontogenese und die Expansionsdynamik von CHIP und vertiefen unser Verständnis von den klinischen Assoziationen und ihrer Rolle während chemotherapeutischer Behandlungen und der allogenen Stammzelltransplantation.