EBV in partiell EBER-positiven Non-Hodgkin-Lymphomen und epithelialen Tumoren: Infektionsstatus und Bedeutung für die Tumorgenese

Abstract

Hintergrund: Es ist eine bisher nicht verstandene Beobachtung, dass sich in einigen EBV-infizierten Non-Hodgkin-Lymphomen und Karzinomen nur in einem Teil der Tumorzellen die zum in situ Nachweis einer EBV-Infektion verwendete EBER- RNA darstellen lässt. Zur Erklärung dieser Beobachtung wurden verschiedene Erklärungshypothesen aufgestellt: 1\. Die Tumoren sind oligoklonal und bestehen aus unterschiedlichen und nicht verwandten EBV-positiven und EBV- negativen Zellklonen. 2\. Ein Teil der Tumorzellen eliminieren oder verlieren ihr EBV-Genom (EBV-Verlust). 3\. Eine Fraktion des ursprünglich EBV-negativen Tumors wurde sekundär mit EBV infiziert (Sekundärinfektion). 4\. Die viralen Gene, die für EBER kodieren, sind in ihrer Aktivität vermindert oder inaktiv. In diesem Fall könnte die Tumorzelle trotz fehlender Nachweises von EBER mit EBV infiziert sein. In der vorliegenden Arbeit untersuchten wir das Phänomen der partiellen EBER-Positivität an vier partiell EBER-positiven B-Zell-Non- Hodgkin-Lymphomen und vier partiell EBER-positiven epithelialen Tumoren. Methoden: Mit formalinfixierten Schnitten der Tumoren wurde eine EBER-in situ- Hybridisierung durchgeführt. Einzelne EBER-positive und EBER-negative Tumorzellen wurden isoliert und mittels hoch sensitiver Einzelzell-PCR auf das Vorhandensein von EBV-DNA untersucht. Ergebnisse: Insgesamt wurden 174 Lymphomzellen aus vier B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen untersucht, davon 88 EBER- positive und 86 EBER-negative Tumorzellen. 38 (43%) der EBER-positiven und eine (1,2%) der EBER-negativen Lymphomzellen waren EBV-PCR-positiv. Von den als Negativ-Kontrollen durchgeführten Pufferproben war eine (0,6%) EBV-DNA- positiv. Aus drei Magenkarzinomen und einem Nasopharynxkarzinom wurden insgesamt 121 Karzinomzellen untersucht, darunter 46 EBER-positive und 75 EBER-negative Tumorzellen. 40 (87%) der EBER-positiven und 34 (45,3%) der EBER-negativen Karzinomzellen zeigten EBV-DNA in der PCR. Von 48 als Negativ- Kontrollen untersuchten EBER-negativen Lymphozyten zeigten zwei (4,2%) EBV- DNA, keine der untersuchten Pufferproben enthielt EBV-DNA. Schlussfolgerungen: Bei den partiell EBER-positiven B-Zell-Non-Hodgkin-Lymphomen enthalten alle EBER-positiven Lymphomzellen auch tatsächlich EBV-DNA, hingegen sind die EBER- negativen Lymphomzellen frei von EBV. Bei den epithelialen Tumoren findet sich EBV-DNA sowohl in den EBER-positiven als auch in den EBER-negativen Tumorzellen, allerdings in den positiven Tumorzellen in größerer Anzahl. Unsere Ergebnisse zeigen, dass der Mechanismus, der zu partiell EBER-positiven Tumoren führt, in Lymphomen anders ist als in Karzinomen. Wir vermuten, gestützt durch in vitro Daten aus der Literatur, dass in beiden Formen zu Beginn der Tumorentstehung alle Tumorzellen EBV-infiziert waren. Während in EBER-negativen Karzinomzellen vermutlich die EBV-Infektion persistiert, wobei allerdings das EBER-Gen weitgehend inaktiv ist, haben die EBER-negativen Lymphomzellen anscheinend das EBV-Genom verloren.

Background: It is an unexplainable observation, that in some EBV-infected Non- Hodgkin-Lymphoma and Carcinoma the EBER-RNA as a commonly used in-situ detection of EBV can be detected in only a part of the malignant cells. Several models were made to explain this finding: 1\. The tumors are oligoclonal and constist of different clones of unrelated EBER-positive and EBER-negative cells. 2\. A part of the tumor cells eliminate or lose their genome 3\. A fraction of a first EBV-negative tumor gets infected secondarily 4\. The viral genes encoding for EBER are downregulated or inactiv. In that case tumor cells could be EBV-infected without exoressing EBER. This study we surveyed the phenomenon of partial EBER-positivity on four partial EBER- positive B-cell Non-Hodgkins-Lymphoma and four partial EBER-positive Carcinoma. Methods: An EBER in-situ hybridization was performed on formalin fixed tissue slides of the tumors. Single EBER-positive and EBER-negative tumor cells were isolated and examined for EBV-DNA with high sensitive single- cell PCR. Results: We examined 174 lymphoma cells from four B-cell Non- Hodgkin-Lymphoma, 88 of them EBER-positive and 86 EBER-negative. 38 (43%) of them EBER-positive and one (1,2%) of the EBER-negative tumorcells were found to be EBV-PCR positive. One out of 166 negative controlls (pure buffer solution) showed a EBV-DNA signal. 121 carcinoma cells were isolated from three gastric carcinoma and one nasopharyngeal carcinoma, 46 of them EBER- positive and 75 EBER-negative. 40 (87%) of the EBER-positive and 34 (45,3%) of the EBER-negative carcinoma cells showed a positive signal in the EBV-PCR. 48 EBER-negative lymphocytes and 122 buffer probes served as negative controll, two of the lymphocyted showed a positive EBV-DNA signal, non of the bffer probes did so. Discussion: in partial EBER-positive B-cell non-hodgkin- lymphoma EBER-positive tumor cells contain EBV-DNA, whereas the EBER-negative tumor cells are free of EBV-DNA. In contrast, in carcinoma, both EBER-positive and EBER-negative cells contain EBV-DNA, but EBER-positive tumor cells contain more EBV-DNA. Our results show, that the mechanism leading to partial EBER- positive tumors is different between lymphoma and carcinoma. Reviewing the literature about in-vitro investigations, we presume, that in both types of tumors all tumor cells were infected at the time of tumor origin. While in EBER-negative carcinoma cells the EBV-infection probably persists, but the EBER-gene is downregulated. In contrast, the EBER-negative tumor cells lost the EBV-genome.