Induktion von Proteinen der extrazellulären Matrix durch VEGF in der perfundierten Arterie der humanen Nabelschnur

Abstract

Diese Dissertation untersucht die frühen Effekte von VEGF auf die Proteine der extrazellulären Matrix (EZM) und auf die vaskuläre Permeabilität an humanen Umbilikalarterien. Es ist bekannt, dass VEGF die Akkumulation von Proteinen der EZM in mesangialen und endothelialen Zellen induziert und zu einer gesteigerten vaskulären Permeabilität führt. So ist eine Vielzahl an Erkrankungen, die mit lokalen und generalisierten Ödemen einhergehen, durch einen erhöhten Serumspiegel von VEGF gekennzeichnet. Die Untersuchungen dieser Arbeit werden mit einem eigens etablierten Perfusionsmodell der humanen Nabelschnur durchgeführt. Die Nabelschnüre von reifen, gesunden Neugeborenen, die via Sectio caesarea entbunden wurden, werden in 3 Untersuchungsgruppen randomisiert: 1\. nicht perfundierte unbehandelte Nabelschnursegmente (0-Probe), 2\. perfundierte unbehandelte Nabelschnursegmente (-VEGF) sowie 3\. perfundierte mit VEGF165 behandelte Nabelschnursegmente (+VEGF). Der Untersuchung, Präparation und intraarteriellen Applikation von VEGF165 (2 ng/ml) oder Kontrollmedium folgt eine Adaptationszeit von 90 Minuten Dauer bei 37 °C. Im Anschluss werden die Nabelschnursegmente für 4 Stunden perfundiert. Arterieller Perfusionsdruck und vaskulärer Fluss werden kontinuierlich gemessen. Die Gefäße werden nach Abschluss des Experiments mittels Hämatoxilin-Eosin-Färbung, Sirius-Rot-Färbung, Polarisationslicht-Mikroskopie, Transmissionselektronenmikroskopie, Immunhistochemie und Western Blot-Analyse untersucht. Das interstitielle Ödem wird durch die Extravasation des Farbstoffes Evans Blau visualisiert und vermessen. Durch die Extravasation von Evans Blau kann nach 4 Stunden Perfusion ein signifikantes interstitielles Ödem in der VEGF165-behandelten Gruppe gefunden werden. Mit Hilfe immunhistochemischer Untersuchungen und Western Blot-Analysen wird nachgewiesen, dass die intraarterielle Applikation von VEGF165 zu einer signifikanten Zunahme der EZM-Proteine Kollagen Typ IV und Laminin im Vergleich zur nicht perfundierten unbehandelten (0-Probe) und zur perfundierten unbehandelten Kontrollgruppe (-VEGF) führt. Darüber hinaus kommt es zu einer signifikanten Induktion von Flt-1, Flk-1 und Osteopontin nach VEGF165-Behandlung, die immunhistochemisch und mittels Western Blot-Analyse nachgewiesen wird. Parallel findet sich ein Anstieg von ß1-Integrin. Die in dieser Dissertationsschrift präsentierten Daten dokumentieren, dass die intraluminale Applikation von VEGF165 zu einem signifikanten Anstieg der Proteine der EZM in der humanen Umbilikalarterie führt. Osteopontin und ß1-Integrin werden ebenfalls von VEGF165 induziert und sind möglicherweise von entscheidender Bedeutung bei vaskulären Remodeling-Prozessen. Die Erhöhung der vaskulären Permeabilität durch die Interaktion von VEGF165 mit seinen Rezeptoren spielt auch im Bereich der Umbilikalarterie eine Rolle. Weitere Untersuchungen müssen an einem in vivo-Modell durchgeführt werden, um die Ergebnisse dieser Dissertation zu validieren. Da die Konditionen der in vivo- Situation sehr ähnlich sind, können mit dem hier etablierten Modell pharmakologische und gefäßbiologische ex vivo-Studien an menschlichen Gefäßen durchgeführt werden. Dadurch können Tierversuche auf dem Gebiet der vaskulären Biologie und Pharmakologie ersetzt werden.

VEGF induces extracellular matrix (ECM) accumulation in mesangial and endothelial cells. The precise mechanisms that mediate VEGF-induced ECM expansion remain poorly characterized. Therefore, we established a human perfusion model to investigate the early effects of VEGF on ECM proteins and vascular leakage in human umbilical arteries. In a human vessel perfusion model, we investigated the impact of intraluminal application of VEGF165 (n=10; dose 2 ng/ml) on the umbilical artery. 10 other umbilical cords served as non-treated controls and 10 segments of umbilical cords served as non- perfused, non-treated controls. Arterial pressure and vascular flow were measured online. Vessels were evaluated by Hematoxilin Eosin staining, Sirius red staining, polarization microscopy, electron microscopy, Western blotting and immunohistochemistry. Evans blue extravasation was used to determine a tissue edema. A significant tissue edema was detected after 4 h in VEGF treated arteries. VEGF165 significantly increased laminin and collagen type IV compared to perfused and non-perfused controls. Furthermore, VEGF treatment significantly induced Flt-1, Flk-1 and osteopontin. In parallel, we detected a significant increase in ß1-integrin. Our data clearly document for the first time that intraluminal application of VEGF increases ECM proteins in the umbilical artery. Osteopontin and ß1-integrin induced by VEGF may play an important role in the vascular remodeling process.