Nanopartikel als Trägersysteme für transepidermale Vakzinierung – Zielgerichteter Transport von Antigenen über die Hautbarriere

Abstract

Ziel dieser experimentellen Arbeit waren Untersuchungen zum Targeting epidermaler Langerhanszellen sowie dem Antigentransport mittels Nanopartikel gekoppeltem p24-Antigen im Hinblick auf eine transepidermale Immunisierung. Zu diesem Zweck wurden die follikuläre Penetration von Partikeln in menschlicher Haut, das Aufnahmeverhalten durch epidermale Langerhanszellen und die Aktivierung derer durch p24-Antigen beladene Partikel untersucht. Es zeigte sich, dass nach einem CSSS und dem Auftragen unterschiedlich großer und beschichteter Partikeltypen (PLA/PS-Partikel, >/< 200nm, +/-p24-Antigen) auf exzidierte humane Haut eine Penetration entlang des Haarfollikels erfolgte. Mittels der Fluoreszenzmikroskopie ließen sich in mehr als der Hälfte (50-70 %) der untersuchten Haarfollikel PLA- sowie PS-Partikel nachweisen. Bei PLA- Partikeln einer Größe > 200 nm zeigte sich in etwa 20 % der HF eine Penetration bis zum tiefen Infundibulum. Somit stellt sich der follikuläre Weg als geeignet für transepidermale Vakzinierungsstrategien dar, da über ihn die immunkompetenten Zielzellen der Haut, die im Bereich des distalen Infundibulums resident sind, erreicht werden können (Targeting). Das zweite Ziel dieser experimentellen Arbeit war, aufbauend auf die vorangegangenen Penetrationsuntersuchungen, eine Aufnahme der p24-gekoppelten Partikel durch die LZ nach transfollikulärer Penetration nachzuweisen. Die epidermalen LZ gelten als potente Immunzellpopulation und können durch Internalisierung der Antigen-beladenen Nanopartikel möglicherweise zusätzlich über MHC-I-Kreuzpräsentation des Antigens eine effektive zelluläre Immunantwort initiieren; diese ist gerade im Hinblick auf transepidermale Immunisierungsstrategien gegen HIV von großer Bedeutung. Alle im Rahmen dieser experimentellen Arbeit untersuchten PS-Partikel (>/< 200 nm, +/- p24-Antigen) konnten nach topischer Applikation durch die Hautbarriere in die epidermalen Zellschichten gelangen und von den dort residenten Langerhanszellen aufgenommen werden. Es zeigte sich in der Durchflusszytometrie eine größenabhängige Aufnahme der Partikel durch epidermale LZ, die Zahl der „Partikel-positiven“ Zellen schwankte zwischen 1,5-3,5 %. Somit wird sichtbar, dass die intrazelluläre Aufnahme der Partikel größenabhängig erfolgt und auch für die Penetrationseigenschaften wesentlich ist. Eine Aufnahme von PLA- Partikeln konnte, wie auch in früheren Untersuchungen gezeigt, nicht nachgewiesen werden und liegt möglicherweise an der Instabilität der Partikel mit nachfolgender Freisetzung des Farbstoffes sowie Konglomeratbildung. Neue unpublizierte Forschungsergebnisse der AG Dr. A. Vogt zeigen jedoch, dass sich HIV-1-p24-Antigen, welches an PLA-Partikel gekoppelt ist, nach transepidermaler Applikation in epidermalen LZ nachweisen lässt und somit prinzipiell für eine Translokation des Antigens über die Hautbarriere spricht. Nach der Untersuchung der follikulären Penetration sowie Aufnahme der Partikel durch epidermale LZ bestand der letzte Teil dieser experimentellen Arbeit in der Erforschung der Aktivierung der LZ durch p24-Antigen beschichtete Partikel. Es zeigte sich eine Stimulation der Immunzellen nach einem CSSS und transkutaner Applikation vor allem mit PLA 215_p24 durch Hochregulierung der Aktivierungsmarker CD80 sowie CD83. Da speziell PLA-Partikel bioabbaubar sind, gelten sie als attraktive Trägersysteme für transkutane Immunisierungsstrategien. In der hier vorliegenden Dissertation konnte bestätigt werden, dass p24-PLA-Partikel über den Haarfollikel penetrieren und die LZ aktivieren, was für die Initiierung einer effektiven Immunantwort von Bedeutung ist. Auch ist eine Aufnahme transepidermal applizierter Partikel mit p24-Antigen durch LZ möglich und im Hinblick auf ein Targeting der epidermalen Immunzellpopulation wünschenswert. Diese Arbeit zeigt, dass Nanopartikel mit p24-Antigen als Träger für eine transepidermale Immunisierung viel versprechend sind, da sie sowohl über den follikulären Kanal penetrieren, über die Hautbarriere translozieren, dort von epidermalen Langerhanszellen aufgenommen werden und diese zusätzlich stimulieren.

The objective of this experimental work was to investigate the complex interaction of nanoparticles and epidermal Langerhans cells with regard to the possibilities of transepidermal immunisation. For that purpose we looked into the process of follicular penetration of nanoparticles into human skin, the reaction of absorption of antigen-coated nanoparticles by LCs and their activation by various particle types. It was shown that penetration via the hair follicle duct took place after a CSSS and application of p24-antigen coated particle types of different sizes and material classes. By means of fluorescence microscopy proof of PLA and PS-particles could be established in more than half of the examined hair follicles. With PLA Particles >200nm penetration into the deep infundibulum could be detected. Because of this the follicular pathway seems to be suitable for transcutaneous vaccination strategies as by that method the immune competent target cells of the skin which are resident in the area of the distal infundibulum can be reached. He second aim of this experimental work was to give proof of internalisation of the particles by the LCs after transfollicular penetration. The epidemal LCs are regarded as potent immune cell population and might initiate a strong cellular immune response by internalisation of antigen-coated nanoparticles, additionally via MHC-1 cross-presentation of antigen. In view of transepidermal immunisation strategies, especially against the HI-Virus this fact is of utmost importance. For this reason the internalisation of PS- particles +/- p24 antigen by Langerhans cells was investigated after topic application. All PS-particles investigated within the bounce of this work were taken up after topic application by the Langerhans cells. In flow cytometry absorption by Langerhans cells took place corresponding to the size of particles. Therefore it is apparent that the intracellular internalisation of particles works dependent on size and is also essentiell for the quality of penetration,. The last part of these experimental studies was to look more closely into the activation of Langerhans cells by p24 antigen-covered particles. Stimulation of immune cells after transepidermal incubation was discovered, especially with PLA 215 p24 particles due to higher regulation of the activation markers CD 80 and CD83. As especially PLA-particles are biodegradable they are considered as attractive carrier systems for transcutaneous vaccination strategies. Fundamental absorption of transepidermally applied particles coated with antigen by LCs is not only possible, it is also highly desirable concerning the targeting of epidermal immune cell population. The studies show that nanoparticles as antigen-carrier systems are most promising as they penetrate via the follicluar duct as well as translocate through the skin barrier where they are absorbed by LCs and furthermore stimulate them.