Epidemiology, genotyping and antibiotic resistance of zoonotic bacteria isolated from poultry in Egypt

Abstract

Poultry and poultry products are considered as major reservoirs for many zoonotic pathogens that are incriminated in human foodborne diseases globally. Moreover, these pathogens have contributed to the actual global challenge of antimicrobial resistance (AMR) with the use of antibiotics in the food production industry. The poultry industry is one of the mainstay sources of Egyptian economy. Nonetheless, turkey production is still limited to a small scale. Few studies have discussed the probability of transmission of zoonotic pathogens and AMR between turkeys and humans in Egypt. The global rise of ESBL- and carbapenemase-producing Gram-negative bacteria demands intensified surveillance. ESBL-producing and colistin-resistant Escherichia (E.) coli in poultry farms in Egypt are of major concern that emphasizes the possibility of spread of such strains and associated resistance genes including plasmid-mediated mcr-1 gene to humans. Enterobacteriaceae strains were isolated and identified as E. coli (87.5%), Enterobacter cloacae (6.9%), K. pneumoniae (2.8%) and Citrobacter spp. (2.8%). ESBL-producing was confirmed in 12.5% of E. coli isolates while only 1.8% of isolates were confirmed as ESBL/carbapenemase-producing E. coli. The mcr-1 gene was identified in 7.9% of phenotypically colistin resistant E. coli isolates. The most prevalent resistance gene was blaTEM, which was identified in 85.7% of ESBL and AmpC β-lactamase-producing isolates, while blaCMY-2 and blaOXA-7 were detected in 3.2% of ESBL and AmpC β-lactamase-producing isolates. Only 1.6% of ESBL-producing E. coli isolates possessed blaCTX-M9, blaCTX-M1-15, blaOXA-1, blaDHA-1, blaLAP-1 and blaSHV genes. The virulence-associated genes detected by microarray analysis were differently distributed among the isolated E. coli including secretion system (cif, espA, espF_O103H2, espJ, nleA, nleB O157:H7 and tccP), adhesion-involved genes (eae and iha genes) and serine protease autotransporter genes (tsh, pic and vat). Several toxin genes were detected including astA, cma, hlyE, mchF, sat and senB and fimbriae virulence genes (lpfA and prfB). Miscellaneous genes encoding virulence factors including hemL, intI1, ireA, iroN, iss and tir genes were identified. It was shown that molecular biological methods such as microarray investigation are reliable and fast tools for detection of genoserotypes, resistance- and virulence-associated determinants (Chapter 2). The coagulase negative staphylococci (CoNS) are implicated in serious infections in both, humans and animals. They show high resistance to several antibiotics and gain a great research interest. Nevertheless, there are very few data available on the prevalence and resistance profiles of CoNS in Egypt. Different CoNS species were isolated from apparently healthy turkeys located in five governorates in Egypt. The CoNS species were identified using MALDI-TOF MS as S. lentus (41%), S. xylosus (20.5%), S. saprophyticus (12.8%), S. sciuri (7.7%), S. condimenti (5.12%), S. cohnii (5.12%), S. simulans (2.6%), S. epidermidis (2.6%) and S. arlettae (2.6%). The susceptibility testing of CoNS isolates was performed using the broth microdilution test. All isolates were phenotypically resistant to trimethoprim/sulfamethoxazole, penicillin, ampicillin and tetracycline. The resistance rates to erythromycin, chloramphenicol, oxacillin, daptomycin and tigecycline were 97.4%, 94.9%, 92.3%, 89.7% and 87.2%, respectively. Thirty-one isolates were resistant to linezolid (79.5%). Low resistance rate was detected for both, imipenem and vancomycin (12.8%). The presence of resistance-associated genes mecA, vanA, blaZ, erm(A), erm(B), erm(C), aac-aphD, optrA, valS and cfr was determined. The erm(C) gene was identified in all erythromycin phenotypically resistant isolates, whereas two resistant isolates possessed three resistance-conferring genes erm(A), erm(B) and erm(C). The cfr and optrA genes were detected in 35.5% and 38.7% of the phenotypically linezolid-resistant isolates. The mecA, aac-aphD and blaZ genes were identified in 22.2%, 41.9%, and 2.6% of phenotypically resistant isolates to oxacillin, gentamicin and penicillin, respectively. This is the first study revealing the correlation between linezolid resistance and presence of cfr and optrA genes in CoNS isolates in Egypt. This study has demonstrated that both human and poultry can act as a vector for CoNS harboring antimicrobial resistance genes. Multidrug-resistant CoNS are a threat in both, human and veterinary medicine (Chapter 3). There are no geographical boundaries that can hamper the worldwide spread of AMR. If preventive measures are not applied from farm-to-fork locally, nationally and globally, the tottering situation in one country can easily compromise the efficacy and threaten AMR control policies in other parts of the world.

Geflügel und Geflügelprodukte gelten als Hauptreservoir für viele zoonotische Pathogene, welche weltweit für humane, durch Lebensmittel verursachte Erkrankungen verantwortlich gemacht werden. Diese Krankheitserreger erlangen eine besondere Bedeutung durch die global zunehmende Ausbildung von Resistenzen gegenüber antimikrobiell wirksamen Substanzen, wofür die Verwendung von Antibiotika in der Lebensmittelindustrie mitverantwortlich gemacht wird. Die Geflügelindustrie ist ein wichtiger Sektor der ägyptischen Ökonomie. Dabei liefert die Puten-Produktion jedoch insgesamt nur einen geringen Beitrag. Es gibt ein paar Studien, in denen eine mögliche Übertragung von zoonotischen Erregern und der damit einhergehenden Antibiotikaresistenz zwischen Puten und Mensch in Ägypten diskutiert werden. Der weltweite Anstieg von ESBL- und Carbapenemasen-produzierenden Gram-negativen Bakterien erfordert eine intensive Überwachung. ESBL-produzierende und Colistin-resistente Escherichia coli-Stämme in Geflügelfarmen in Ägypten spielen eine wichtige Rolle, weil die Möglichkeit des Verbreitens und der Übertragung solcher Isolate und der damit verbundenen Resistenzgene einschließlich des Plasmid-lokalisierten mcr-1-Gens auf Menschen besteht. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden Vertreter der Enterobacteriaceae isoliert und identifiziert: Escherichia coli (87,5 %), Enterobacter cloacae (6,9 %), Klebsiella pneumoniae (2,8 %) und Citrobacter-Spezies (2,8 %). Unter den Escherichia coli-Isolaten befanden sich 12,5 % ESBL-Produzenten, während nur 1,8 % ESBL/Carbapenemasen-produzierend waren. Das mcr-1-Gen konnte in 7,9 % der phänotypisch resistenten Escherichia coli-Isolate nachgewiesen werden. Das am häufigsten nachgewiesene Resistenzgen war blaTEM, welches 85,7 % der ESBL- und AmpC β-Lactamase-produzierenden Isolate trugen, während blaCMY-2 und blaOXA-7 in 3,2 % dieser Isolate gefunden wurden. Jeweils 1,6 % der ESBL-produzierenden Isolate trugen folgende Gene: blaCTX-M9, blaCTX-M1-15, blaOXA-1, blaDHA-1, blaLAP-1 und blaSHV. Die durch Mikroarray-Analyse identifizierten Virulenz-assoziierten Gene waren unterschiedlich in den Escherichia coli-Isolaten verteilt. Unter den untersuchten Genen befanden sich solche des Sekretionssystems (cif, espA, espF_013H2, espJ, nleA, nleBO157:H7 und tccP), Gene, die im Adhäsionsprozess beteiligt sind (eae und iha) und Serinprotease-Autotransporter-Gene tsh, pic und vat). Verschiedene Toxin-Gene (astA, cma, hlyE, mchF, sat und senB) wurden ebenso nachgewiesen wie Virulenzgene, die im Zusammenhang mit Fimbrien stehen (lpfA und prfB). Die Anwesenheit von Genen weiterer Virulenzfaktoren in den Isolaten konnte bestätigt werden (hemL, intl1, ireA, iroN, iss und tir). Es wurde gezeigt, dass molekularbiologische Nachweismethoden wie Mikroarray-Untersuchungen zuverlässige und schnelle Werkzeuge für den Nachweis von GenoSerotypen, Resistenz- und Virulenz-assoziierten Determinanten sind (Kapitel 2). Auch Koagulase-negative Staphylokokken sind bei ernsthaften Infektionen beim Menschen und bei Tieren beteiligt. Sie zeigen oftmals Resistenz gegenüber verschiedenen Antibiotika und haben großes Interesse in der Forschung geweckt. Allerdings sind für Ägypten nur wenige Daten hinsichtlich der Prävalenz und der Resistenzprofile von Koagulase-negativen Staphylokokken verfügbar. Verschiedene Koagulase-negative Staphylokokken-Spezies wurden von gesunden Puten aus fünf Gouvernoraten in Ägypten isoliert. Die Staphylokokken wurden mittels MALDI-TOFMassenspektrometrie identifiziert: Staphylococcus lentus (41,0 %), Staphylococcus xylosus (20,5 %), Staphylococcus saprophyticus (12,8 %), Staphylococcus sciuri (7,7 %), Staphylococcus condimenti (5,12 %), Staphylococcus cohnii (5,12 %), Staphylococcus simulans (2,6 %), Staphylococcus epidermidis (2,6 %) und Staphylococcus arlettae (2,6 %). Die Antibiotika-Empfindlichkeitstestung wurde mittels “Broth Microdilution Test” durchgeführt. Alle Isolate erwiesen sich als resistent gegenüber Trimethoprim/Sulphametoxazol, Penicillin, Ampicillin und Tetrazyklin. Die Resistenzraten gegenüber Erythromycin, Chloramphenicol, Oxacillin, Daptomycin und Tigecyclin betrugen 97,4 %, 94,9 %, 92,3 %, 89,7 % und 87,2 %. Einunddreißig Isolate waren resistent gegenüber Linezolid (79,5 %). Eine niedrige Resistenzrate wurde jeweils für Imipenem und Vancomycin (12,8 %) gefunden. Die Anwesenheit folgender Resistenz-assoziierter Gene wurde bestimmt: mecA, vanA, blaZ, erm(A), erm(B), erm(C), aac-aphD, optrA, valS und cfr. erm(C) konnte in allen phänotypisch Erythromycin-resistenten Isolaten identifiziert werden, wobei zwei Isolate drei Erythromycin-Resistenz-vermittelte Gene trugen (erm(A), erm(B), erm(C)). Die cfr- und optrA-Gene wurden in 35,5 % und 38,7 % der phänotypisch Linezolid-resistenten Isolate gefunden, während die Präsenz von mecA (Oxacillin-Resistenz), aac-aphD (Gentamicin-Resistenz) und blaZ (Penicillin-Resistenz) zu 22,2 %, 41,9 % und 2,6 % dieser Isolate bestimmt wurde. Diese Studie war die erste, welche sich mit dem Zusammenhang von Linezolid-Resistenz und der Präsenz der cfr- und optrA-Gene in Koagulase-negativen Staphylokokken in Ägypten befasst hat. Sie zeigte eindeutig, dass Mensch und Geflügel als Vektor für Koagulase-negative Staphylokokken, welche Resistenzgene tragen, agieren kann. Multi-resistente Koagulasenegative Staphylokokken stellen damit eine Bedrohung in der Human- und Veterinärmedizin dar (Kapitel 3). Es existieren keine geographischen Grenzen, die die weltweite Ausbreitung der Antibiotika-Resistenz verhindern können. Es ist notwendig, Präventivmaßnahmen zur Verhinderung einer weiteren Verschlechterung der Resistenzlage durchzuführen. Dies muss lokal, national, aber auch international erfolgen, um so eine Verbesserung bezüglich der Antibiotika-Resistenz von Pathogenen im Lebensmittelbereich zu erreichen