Funktionelle Analyse des Shp2-Gens in der Entwicklung der Muskulatur der Maus

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die Mutation des Shp2flox Allels in Mäusen, in denen die Cre-Rekombinase unter Kontrolle des Pax7-Promoters exprimiert wurde, zu einem Verlust des Shp2 Proteins in Myoblasten zum Zeitpunkt E14 führte (coShp2 Mutante). Dieser Verlust resultierte während der postnatalen Entwicklung in einem verringerten Muskelwachstum, welches sich in einer Reduktion sowohl der Anzahl der Kerne, als auch des Querschnitts der Muskelfaser widerspiegelte. Der Grund für das inhibierte Muskelwachstum war eine Reduktion der Pax7-positiven Satellitenzellpopulation sowie der Myf5- und Myogenin-positiven Myoblastenpopulationen. Die Abnahme dieser Zellpopulationen manifestierte sich zum Ende der Fetalentwicklung sowohl in der hypaxialen, als auch in der epaxialen Muskulatur und setzte sich während der postnatalen Entwicklung fort. Am Ende des untersuchten Zeitraums (P14) konnten nur noch sehr wenige Satellitenzellen und Myoblasten nachgewiesen werden. Der Grund für den Rückgang dieser Zellpopulationen war eine massive Reduktion der Proliferationsraten. Die molekulare Ursache für die eingeschränkte Proliferation der myogenen Zellen in der coShp2 Mutante liegt vermutlich in einer Beeinträchtigung des Akt/PI3K-Signalwegs. Es konnte auf proteinbiochemischem Wege gezeigt werden, dass die Aktivität dieses Signalwegs im Muskelgewebe der coShp2 Mutante reduziert war. Zudem war die Proliferation der myogenen Zellen bei konstitutiver Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs unabhängig vom Shp2 Verlust gesteigert. Die späte Manifestation des Phänotyps in coShp2 Mäusen deutet darauf hin, dass grundlegende Unterschiede in der Regulierung der Proliferation myogener Zellen zwischen der frühen Muskelentwicklung und der Muskelentwicklung ab der späten fetalen Phase bestehen. Eine Änderung in der Muskulatur, die zeitlich in etwa mit dem Auftreten dieses Phänotyps korreliert, ist die Positionierung der Satellitenzellen unter der Basalmembran. Dadurch kommt die Satellitenzelle in einen direkten Kontakt mit Laminin in der Basalmembran. Eine Arbeitshypothese ist daher, dass die durch den Verlust von Shp2 beeinträchtigte Proliferation myogener Zellen auf einer gestörten Weiterleitung von Signalen eines Integrin- Rezeptors beruht, der an Laminin in der Basalmembran bindet. Es ist jedoch auch möglich, dass unbekannte Wachstumsfaktoren, die Shp2-abhängig signalisieren, von der Muskelfaser produziert werden. Sie würden erst dann eine dominante Funktion ausüben, wenn die Satellitenzelle zusammen mit der Faser durch die Basalmembran abgeschirmt wird.

In this work it was shown that a recombination of a Shp2flox allele recombined in a cre-dependent manner under control of the Pax7 promoter (coShp2 mice) results in a loss of Shp2 protein in myoblasts after embryonic day 14 (E14). The outcome of this loss is a reduced muscle growth reflected by a reduction of nuclei and cross sectional area of myofibers during postnatal development. The reason for the impaired muscle growth was a reduced number of Pax7-positive satellite cells as well as Myf5- and Myogenin-positive myoblasts. At the end of fetal development reduction of these cell populations became manifest in hypaxial and epaxial muscle. During development this reduction continued and at postnatal day 14 (P14) only few satellite cells and myoblasts could be detected. The reduction of cell populations was due to a strongly impaired proliferation of myogenic cells. The molecular mechanism underlying the impaired proliferation might be an inhibited activation of Akt /PI3K-pathway. A reduced activity of this pathway in muscle of coShp2 mice was shown on western blots. In addition, in mice with constitutively activated Akt /PI3K-pathway, proliferation of myogenic cells was up regulated independent of Shp2 loss. The late manifestation of the phenotype in coShp2 mice points to the fact that fundamental differences exist between the adjustment of myogenic proliferation in early muscle development and the muscle development after late fetal phase. A difference in muscle which corresponds temporally with the occurrence of the coShp2 phenotype, is the positioning of satellite cells under the basallamina. Thus the satellite cell gets direct contact with laminin in the basallamina. This leads to a working hypothesis where the impaired proliferation of myogenic cells in coShp2 mutants is based on disturbed signaling of an integrin receptor, which binds to laminin in the basallamina. However it is also possible that unknown growth factors, which are signaling in a Shp2-dependent manner, are produced by the muscle fiber. After the satellite cell and the fiber become shielded by the basallamina these factors would be able to act in a dominant manner.