Identifizierung veränderter Proteinexpression durch 2D-Gelelektrophorese beim Nijmegen Breakage Syndrom

Abstract

Das Nijmegen Breakage Syndrom (NBS) gehört als autosomal-rezessive Erkrankung zu den Chromosominstabilitätssyndromen und ist gekennzeichnet durch kraniofaziale Dysmorphie, Minderwuchs, Mikrozephalie, Immundefizienz und einem erhöhten Risiko für die Entwicklung maligner Tumoren. Da die Funktionen des Genprodukts Nibrin noch nicht vollständig geklärt sind, war es Ziel dieser Arbeit, Veränderungen und Modifikationen auf Proteinebene zu untersuchen. Für ein besseres Verständnis wurden hierfür homozygot nullmutante murine Fibroblasten aus einem Knockout-Modell bestrahlt und das Proteom mittels 2D- Gelelektrophorese dargestellt. Mit Hilfe der Maldi TOF Massenspektrometrie wurden die gegenüber heterozygoten Zellen differenziell exprimierten Proteine analysiert und durch die Datenbank identifiziert. Hierbei wurden 35 differenziell exprimierte Proteine mit einem signifikanten Mowse-Score gefunden, von denen 21 verstärkt und 14 vermindert exprimiert wurden. Nach funktionellen Gesichtspunkten gruppiert ergaben sich die Kategorien Energie- Metabolismus, Protein-Metabolismus, Chaperone, Zellzyklus/Proliferation, Signaltransduktion, Transkription/Translation, Zytoskelett und Kollagen. Besonders auffällig ist die hohe Anzahl detektierter Proteine, die den Gruppen der Heat Shock Proteine und der Proteasome angehören. Dies deutet auf deren Beteiligung an der Zellzykluskontrolle und Checkpointkontrolle hin, welche in Nibrindefizienten Zellen gestört sind und somit alternative Mechanismen gefragt sind. Ebenso kann deren verstärkte Aktivität mit der bei NBS-Patienten beobachteten Tumorgenese assoziiert sein. Möglich scheint auch eine Rolle Nibrins im Rahmen der ROS-Regulation und somit ein Fehlen Nibrins relevant für einige Merkmale des Nijmegen Breakage Syndroms. Bemerkenswert ist auch die Identifizierung von PCNA als Reparaturprotein. Auf Grund des Defizits von Nibrin scheint durch verstärkte Expression von PCNA versucht zu werden, die Checkpointregulation und Reparaturmechanismen aufrecht zu erhalten. In Zusammenschau könnte die klinische Variabilität des Krankheitsbildes in der Variation der verschiedenen Proteine und deren Interaktionen untereinander begründet liegen. Je nach Expressions- und Interaktionsmuster der Proteine ergeben sich unterschiedliche Symptome und deren verschieden starke Ausprägungen mit klinisch-praktischer Relevanz. So können Modifikationen bei der Behandlung von heterozygot betroffenen Erkrankten angewendet werden. Auch das individuelle Risiko, an Krebs zu erkranken, sowie ein möglicher Therapieerfolg im Sinne einer individualisierten Medizin können eingeschätzt werden. Darüber hinaus sind die hier detektierten, differenziell exprimierten Proteine interessante Kandidaten in Zusammenhang mit DNA-Reparatur, Checkpointkontrolle und posttranslationalen Modifikationen und für weitere, tiefer gehende Analysen der Funktionen Nibrins.

In this thesis, differentially expressed proteins in the autosomal genetic disorder Nijmegen Breakage Syndrome were identified by proteome analysis. NBS patients show growth retardation und microcephaly, a characteristic facial appearance, immunodeficiency and an increased risk of cancer; in addition, NBS patient cells were found to be sensitive to ionizing irradiation und have higher levels of spontaneous chromosomal damage. Over 90 % of all patients are homozygous for a truncating mutation, producing two mutated forms of the NBS1 gene product nibrin. For a better understanding of the role of Nibrin, other proteins were identified whose abundance is altered in the absence of Nibrin. Homozygous null mutant fibroblasts of a murine model were exposed to ionising radiation, separated in a two-dimensional gel electrophoresis and then analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry and by searching the Swiss Prot Database. In total, 35 proteins were identified which fall into different functional categories (metabolism, chaperones, cell cycle, signal transduction, transcription/translation, cytoskeleton, collagen). The results confirm Nibrin’s role in cell cycle and checkpoint control as well as tumorigenesis and indicate additional functions of Nibrin. The mechanisms operating in cells to combat DNA damage und mutation are further defined enabling a much more detailed insight into the processes disturbed in patient cells. A more thorough understanding of the chromosome instability syndrome NBS could contribute to further improvements in treatment and, with the introduction of individualised medicine, allow prediction of individual cancer risk und likely response to therapeutic regimes.