Overexpression of HoxA9 in CD150- hematopoietic stem cells leads to rapid progression of acute myeloid leukemia

Abstract

Introduction: The hematopoietic stem cell (HCS) compartment does not represent a homogenous group of cells but instead consists of 3 subsets termed myeloid-biased (My-bi), lymphoid-biased (Ly-bi), and balanced (Bala) HSCs. Each of these possess a distinct pre-programmed proliferation and differentiation behavior, which helps us to determine if only 1 of these subsets contains cells that induce acute myeloid leukemia (AML).

Method: Highly purified HSCs were separated into 2 different subsets Ly-bi (CD150-) and My-bi (CD150+) using fluorescence-activated cell sorting. The sorted cells were transduced with a retroviral vector expressing HoxA9, a gene known to induce AML, and injected into mice (primary hosts). Blood samples were taken regularly and analyzed in terms of leukemic behavior. After euthanizing the mice, spleen and bone marrow were analyzed, and whole bone marrow cells from these mice were serially transplanted into naive mice (secondary hosts). In line with the previous experiments, the leukemic behavior was again examined using blood analysis. Finally, whole bone marrow and spleen from these secondary hosts was transplanted into new tertiary hosts, and the time of survival of these mice was determined.

Results: Mice injected with Ly-bi HSCs expressing HoxA9 displayed a shift of differentiation towards the myeloid lineage and a high percentage of Mac-1 positive cells, which is typical for AML. Additionally, typical signs of leukemia were observed in 70% of the primary hosts, which was characterized by an enlarged spleen. After serial transplantation, the development of leukemia became more aggressive as indicated by increased spleen weight and the loss of blood cell markers. The tertiary host mice died within 4 weeks of transplantation. In contrast, mice injected with My-bi HSCs expressing HoxA9 showed no signs of leukemia in primary host mice and lower levels of HoxA9 expression in bone marrow and spleen. Transduced cells did not differentiate towards the myeloid lineage and did not behave like those of AML. Only after bone marrow serial transplantation were differentiation shifts towards the myeloid lineage and enlarged spleens observed in these mice. Strikingly, the tertiary host mice survived up to 5 months.

Conclusion: Important variations in the onset of primary AML and survival were observed between mice that received Ly-bi and My-bi HSCs when overexpressing HoxA9. Mice that received the transduced subset Ly-bi showed an early onset and a fulminant progress of AML. In contrast to this, mice injected with My-bi HSCs showed a more gradual onset of disease and a longer time of survival.

Einleitung: Das hämatopoetische Stammzellenkompartiment besteht nicht, wie lange angenommen, aus einer homogenen Masse, sondern aus drei verschieden Stammzelluntergruppen: myeloid-biased (My-bi), lymphoid-biased (Ly-bi) und balanced (Bala). Aus dieser Erkenntnis ergeben sich neue Fragestellungen und Antwortmöglichkeiten. In dieser Arbeit wird die Frage behandelt, ob nur eine dieser Untergruppen die Zellen enthält, die eine Akute Myeloische Leukämie (AML) auslösen. Methodik: Zunächst wurden hochreine hämatopoetische Stammzellen in My-bi Stammzellen (CD150+) und Ly-bi Stammzellen (CD150-) unterteilt. Die sortierten Zellen wurden anschließend mit einem HoxA9-exprimierenden retroviralen Vektor (einem AML auslösenden Gen) transduziert und in Mäuse (primäres Wirtstier) injiziert. Bei regelmäßigen Blutkontrollen wurden diese auf leukämisches Verhalten überprüft. Nach dem Töten der Mäuse wurden die Milz und das Knochenmark untersucht, zusätzlich wurden Knochenmarkszellen in neue Mäuse (sekundäres Wirtstier) transplantiert. Bei diesen Mäusen wurde, wie beim ersten Experiment, das leukämische Verhalten mit Hilfe von Bluttests kontrolliert. Schließlich wurden Milzund Knochenmarkszellen dieser Mäuse in tertiäre Wirtstiere transplantiert und es wurde die Überlebenszeit bestimmt. Ergebnisse: Mäuse, die HoxA9-überproduzierende Ly-bi Stammzellen erhalten haben, zeigten eine Verschiebung der Differenzierung hin zur myeloischen Reihe und eine große Anzahl Mac-1-positiver Zellen in Blut, Milz und Knochenmark. Dieses Verhalten ist typisch für die AML. Des Weiteren zeigten 70 % der primären Wirtsmäuse weitere typische Anzeichen von Leukämie, unter anderem eine deutlich vergrößerte Milz. Nach der seriellen Transplantation von Knochenmarkszellen in die sekundären Wirtsmäuse wurde die Leukämie aggressiver, was durch stark vergrößerte Milzen und den Verlust von Blutzellmarkern erkennbar wurde. Die tertiären Mäuse starben alle innerhalb von 4 Wochen. Im Gegensatz dazu traten bei den primären Mäusen, die My-bi-Stammzellen mit HoxA9-Expression erhalten hatten, keinerlei Anzeichen für Leukämie auf. Zudem waren bei diesen eine niedrigere Expression von HoxA9 in Milz und Knochenmark festzustellen, dazu keine Verschiebung der Differenzierung und auch keine anderen Anzeichen für Leukämie. Erst nach der seriellen Transplantation von Knochenmarkszellen kam es zu einer Verschiebung der Differenzierung hin zur myeloischen Reihe und zu vergrößerten Milzen in den sekundären Wirtsmäusen. Als auffällig hat sich erwiesen, dass die tertiären Mäuse bis zu 5 Monate überlebten. Schlussfolgerung: Mäuse, die transduzierte Ly-bi-hämatopoetische Stammzellen erhalten haben, zeigten ein frühes Auftreten und einen deutlicheren Verlauf einer der AML beim Menschen vergleichbaren Leukämie. Auf der anderen Seite ist die Leukämie bei Mäusen, die transduzierte My-bi-Stammzellen erhalten haben, langsamer vorangeschritten und sie haben länger überlebt.