Characterization of the osteopetrotic Clcn7-/- mouse mutant rescued by osteoclast-specific expression of ClC-7

Abstract

Die Struktur des Knochens wird bestimmt durch ein komplexes Zusammenspiel von Osteoblasten, die Knochen aufbauen, und Osteoklasten, die Knochen abbauen. Durch ein Ungleichgewicht dieses Prozesses resultieren Erkrankungen mit veränderter Knochendichte. Die Osteopetrose ist eine generalisierte osteosklerotische Erkrankung, die durch Verlust der Osteoklastenfunktion bzw. Defekte der Osteoklastendifferenzierung entstehen. Das Chloridkanal-Protein ClC-7, das in Osteoklasten stark exprimiert ist, hat eine wichtige Funktion bei der Säuresekretion der Osteoklasten, welche für die Resorptionstätigkeit essentiell ist. Es ist daher folgerichtig, dass ein völliger Verlust des Proteins die infantil maligne Osteopetrose in Mensch (ARO) bzw. einen letalen Osteopetrose-Phänotyp in der Maus zur Folge hat. Darüber hinaus werden in ungefähr 70% der Fällen von dominanter Osteopetrose (ADOII) heterozygote Mutationen im Gen für ClC-7 identifiziert, die statistisch die Menge an funktionellen ClC-7 Dimeren maximal auf 25% reduzieren sollten. Heterozygote Träger rezessiver Mutationen haben keinen Phänotyp. Da es gegenwärtig ungeklärt ist, ab welchem Grad von Funktionsverlust von ClC-7 die Osteoklastenfunktion eingeschränkt wird, wurden in dieser Studie verschiedene Mauslinien mit unterschiedlich starkem ClC-7 Expressionsniveau untersucht. Methoden: Drei Mauslinien (F1, F3, und F7), die ein transgenes Konstrukt, das aus dem Osteoklasten-spezifischen Acp5 (Trap)-Promoter und der ClC-7 cDNA besteht, stabil im Genom integriert haben, wurden mit Clcn7+/- Mäusen verpaart, so dass in der zweiten Generation Clcn7-/- Tg+ Tiere entstanden, bei denen der Funktionsverlust des Clcn7-Gens durch transgene Expression teilweise ausgeglichen wurde. Die Clcn7-/- Tg+ Tiere wurden histomorphometrisch untersucht. Die Strukturparameter und Zellzahlen wurden statistisch (unabhängiger gepaarter t-Test) zwischen den Genotypen und den Linien verglichen. ClC-7 wurde in situ im Vergleich mit anderen Osteoklastenproteinen durch Immunofluoreszenz nachgewiesen. Weiterhin wurden Osteoklasten der verschiedenen Mauslinien in vitro kultiviert. mRNA und Proteine wurden extrahiert und durch quantitative PCR und Western-Blot quantifiziert. Ergebnisse: Clcn7-/- Mäuse und Clcn7-/- Tg+ Tiere der Linie F7 hatten einen gleich schweren osteopetrotischen Phänotyp, so dass keine transgene Expression vorhanden sein konnte. Diese Linie wurde nicht weiter untersucht. Dagegen wurde die Osteopetrose bei den Linien F1 und F3 deutlich abgemildert, was für eine teilweise Wiederherstellung der Osteoklastenfunktion spricht. F3 Mäuse zeigten eine annähernd normale Knochendichte, während F1 Mäuse eine milde Osteopetrose darboten, die in etwa dem Phänotyp der dominanten Osteopetrose entspricht. Die Anzahl der Osteoblasten und die Anzahl der Osteoklasten korrelierte umgekehrt mit der Knochendichte. Die Expression von Clcn7 mRNA und Protein war in beiden Linien überraschend niedrig. In F3 wurde die Proteinexpression auf 5,70±1,4 % gemindert, während die Expression in F1 nur 2,51±0,89 % betrug. Schlussfolgerung: Die Clcn7-/- Tg+ Tiere der Linie F1 zeigten einen milden Osteopetrose-Phänotyp, der einer autosomal dominanten Osteopetrose nahekommt, während in Linie F3 die Knochendichte durch die transgene Expression von ClC-7 im Clcn7-/- Hintergrund annähernd normalisiert wurde. Damit korreliert die Proteinexpression, die jedoch unter den erwarteten Werten von 25-50% liegt. Dies könnte durch einen Speziesunterschied begründet sein. Schlüsselwörte: Knochendichte, Knochenumbau, Chloridkanal, Histomorphometrie, Osteoklast, Ostepetrose, Transgen, Mausmodel

Bone quality is a consequence of simultaneous functions of bone formation cells or osteoblasts and bone resorption cells or osteoclasts. Imbalance function of these cells disturbs bone remodeling and consequently leads to pathological bone diseases. Complete loss of function or insufficient differentiation of osteoclasts causes excessive bone density or osteopetrosis. Intracellular transmembrane protein chloride channel-7 (ClC-7), which is highly expressed in osteoclasts is required for electroneutralization during bone degradation. Complete depletion of the protein gives rise to autosomal recessive osteopetrosis (ARO) in humans and osteopetrosis phenotype in mice. Moreover, in approximately 70% of autosomal dominant osteopetrosis type II (ADO II) patients, heterozygous mutations of CLCN7 are identified. Because ClC-7 structure is dimmers, in which each of two subunits has its own pore, the heterozygous mutations should be encoded for <25% of the entire protein, statistically. However, the mutations’ carriers do not express phenotype. The pathogenesis of the disease remains unclear. Hence, the present study was aimed to explain the mechanism of the diseases relevant to ClC-7 expression. Methods: To answer the question, three transgenic mouse lines were constructed by genome-integration of ClC-7 cDNA which is under control of osteoclast- specific Acp5 (Trap) promoter. Heterozygous mice (Clcn7+/- Tg+) were mated. Then, Clcn7-/- Tg+ mice could be generated in the second generation. Accordingly, ClC-7 could be expressed partially. Bone phenotypes of the transgenic mice with different Clcn7 genotypes were investigated histomorphologically. Structural and cellular parameters were compared between the genotypes, and groups statistically (independent paired t-test). ClC-7 and other osteoclast specific proteins were also determined in situ using the immunofluorescent technique. mRNA and protein extracted from osteoclasts in vitro were examined by quantitative PCR and Western blot analysis, respectively. Results: The Clcn7 knockout mice and F7 showed severe osteopetrosis phenotype, whereas F1 and F3 had different degrees of bone density. F1 rescue mice had mild osteopetrosis phenotype, while F3 rescue mice and heterozygous mice displayed insignificant bone phenotype. Osteoclast and osteoblast numbers were reversely associated with the degree of bone density. Interestingly, Clcn7 mRNA and ClC-7 expressed very low in F1 and F3. Moreover, ClC-7 expression in F3 was 5.70±1.4%, while the average value in F1 was decreased to 2.51±0.89% of control signals. Conclusion: The expression of ClC-7 is associated with the degrees of bone density. Low degree expression of ClC-7 can rescue the osteopetrosis phenotype. The reduced bone resorption function due to impaired ClC-7 prolongs the bone remodeling process and results in mild osteopetrosis. Recessive pattern of the inheritance of the mutated gene leads to severe osteopetrosis in humans and mice, whereas heterozygous mutations cannot affect osteopetrosis phenotype in mice. Thus, the pattern of genotype-phenotype relationship would be different between species. The study would be meaningful for genetic diagnostics and the prediction of severity of the disease. Furthermore, F1 mice displayed a phenotype very similar to ADO II, thus the F1 mice would be a beneficial model for treatment trials of the disease as well as for the study of osteoporosis. Keywords: bone density, bone remodeling, chloride channel, histomorphometry, osteoclast, osteopetrosis, transgene, mice model