Evaluation und Weiterentwicklung eines in vitro Testverfahrens zur Bestimmung des sensibilisierenden Potenzials von Kontaktallergenen

Abstract

Die allergische Kontaktdermatitis ist eine der häufigsten Pathologien des menschlichen Immunsystems und von großer volkswirtschaftlicher Relevanz. Ein konsequentes Screening von Chemikalien auf kontaktallergene Eigenschaften und eine Beschränkung ihrer Verwendung im täglichen Leben kann die Prävalenz dieser Erkrankung senken. Zur Zeit ist der am meisten verwendete Assay für eine solche prädiktive Testung der Local Lymph Node Assay (LLNA) in Mäusen. Aus ethischen Gründen, aber auch in Hinsicht auf kommende gesetzliche Beschränkungen für Tierversuche – z.B. für Kosmetika – ist es wünschenswert, einen in vitro Assay für diese Fragestellung zu entwickeln. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein solcher in vitro Assay – der Loose-fit Coculture-based Sensitization Assay (LCSA) – evaluiert, weiterentwickelt und verfeinert. Der LCSA basiert auf einer Kokultur aus primären humanen Keratinozyten, auf welche allogene humane Monozyten gesät werden. Nach Gabe von Granulozyten/Makrophagen koloniestimulierendem Faktor (GM-CSF), Interleukin-4 (IL-4) und Transformierendem Wachstumsfaktor-beta1 (TGF-beta1) konnten aus den Monozyten Langerhanszell-ähnliche Zellen generiert werden, welche die Fähigkeit besitzen, auf Kontaktallergene zu reagieren. Alle acht getesteten Kontaktallergene konnten eine messbare Reaktion in der Kokultur hervorrufen, sechs davon im Sinne einer Hochregulation von CD86 bei den Langerhanszell- ähnlichen Zellen. Für die zunächst negativ getesteten Metallallergene Nickel und Cobalt konnten im Rahmen dieser Arbeit alternative Parameter gefunden werden: die ins Kulturmedium sezernierten Proteine Macrophage Inflammatory Protein-1beta (MIP-1beta, auch: CCL-4) und Interleukin-6 (IL-6). Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Zeit zur Generierung der Langerhanszell- ähnlichen Zellen, sowie die hierfür benötigten Zytokine reduziert werden können, ohne dass die Aussagekraft des Assays beeinträchtigt wird, wodurch dessen Wirtschaftlichkeit erhöht wird. Neben dem Verzicht auf Tierversuche hat der hier vorgestellte LCSA weitere Vorteile gegenüber dem LLNA in Mäusen: reine Irritanzien (im LLNA oft falsch positiv) riefen hier keine Reaktion hervor, Metallallergene (im LLNA oft nur mit Hilfe spezieller Techniken erkennbar) konnten durch die Implementation zusätzlicher Ausleseparameter positiv getestet werden. Als Nachteil des LCSA muss gelten, dass das Stratum corneum, welches in vivo die erste Barriere für Kontaktallergene darstellt, nicht simuliert wird. So kann die unterschiedlich starke Hautpenetration von Allergenen nicht in deren Risikobewertung mit einbezogen werden. Realistischerweise muss man davon ausgehen, dass nicht ein in vitro Assay allein den LLNA wird ersetzen können, sondern vielmehr eine Zusammenschau der Ergebnisse unterschiedlicher Assays eine detaillierte Bewertung des allergenen Risikopotenzials von Chemikalien möglich machen wird.

The allergic contact dermatitis is one of the most common pathologies of the human immune system and has significant economical impact. Consistent screening of chemicals for allergenic properties and their restriction in daily use could reduce the prevalence of this disease. Currently, the Local Lymph Node Assay (LLNA) in mice is the most popular assay for such predictive testing. For ethical reasons – but also in regard to forthcoming legal restrictions for animal tests, such as for cosmetics – it is desirable to develop an in vitro assay for that issue. Such an in vitro assay – the Loose- fit Coculture-based Sensitization Assay (LCSA) – was evaluated, further developed and refined during the course of this dissertation. The LCSA is based on a coculture of primary human keratinocytes on which allogenic human monocytes were seeded. After application of granulocyte-macrophage colony- stimulating factor (GM-CSF), interleukin-4 (IL-4) and transforming growth factor beta1 (TGF-beta1) the monocytes differentiated towards Langerhans cell- like cells, which were capable of reacting to contact allergens. All of the eight tested contact allergens could evoke a measurable response in the coculture, six of them by upregulation of CD86 in Langerhans cell-like cells. For the two tested metal allergens nickel and cobalt alternative parameters had to be found: the proteins macrophage Inflammatory Protein-1beta (MIP- 1beta, also: CCL-4) and interleukin-6 (IL-6), which were secreted into the cell culture medium. Furthermore, it was shown that the time to generate Langerhans cell-like cells and the consumption of cytokines could be reduced without impairing the validity of the assay, thus improving its cost effectiveness. Beyond refraining from animal testing the LCSA has further advantages over the LLNA in mice: mere irritants (often false positive in the LLNA) showed no reaction; metal allergens (usually only detectable using special techniques in the LLNA) were clearly tested positive after additional read out parameters were implemented. A disadvantage of the LCSA is the fact that the stratum corneum as the outermost barrier for contact allergens in vivo is not simulated. So different skin penetration abilities of allergens cannot be considered for measuring their risk potential. One has to assume that not one in vitro assay alone has the potential of replacing the LLNA but rather the combination of results of multiple in vitro assays may allow for detailed assessment of the allergenic risk potential of chemicals.