Intersectin1 is a component of the Reelin-VLDLR pathway to regulate neuronal migration, adult neurogenesis and synaptic plasticity in the hippocampus

Abstract

Intersectin1 (ITSN1) is a multi-domain scaffold protein with proposed roles in vesicular membrane traffic and cellular signaling events. However, the functional relevance of ITSN1 in mammalian organisms is still under debate. Here, we provide evidence for a so far undescribed function of ITSN1. Mouse mutants with a genetic ablation of ITSN1 (ITSN1 knockout mice) display normal viability and appearance. However, histological analysis of brains from ITSN1 knockout mice revealed marked perturbations in the hippocampus. In these mice, hippocampal layering is disrupted due to aberrant cell migration during development. In addition, the radial glia scaffold in the dentate gyrus is disorganized and neuronal precursors are ectopically localized, indicating deficits in hippocampal adult neurogenesis. Cortical and cerebellar architecture, neurogenesis in the subventricular zone (SVZ), dendritic spine morphology and axonal commissure formation are unaltered in the absence of ITSN1. This suggests that ITSN1 is specifically required for development and function of the hippocampus. A number of cell biological and biochemical experiments revealed that the alterations in ITSN1 knockout mice are not the consequence of defective ephrinB/EphB trafficking or signaling, a pathway previously linked to ITSN1. Instead, the phenotype of ITSN1 knockout mice is caused by defective signaling downstream of the large extracellular glycoprotein Reelin. Biochemical, electrophysiological and genetic data indicate that ITSN1 is specifically required for propagation of the Reelin signal through one of its major receptors, the very-low-density-lipoprotein receptor (VLDLR). ITSN1 associates physically with VLDLR and the Reelin signaling adaptor Disabled1 (Dab1). Despite its described role as endocytic scaffold protein, ITSN1 is dispensable for endocytic trafficking of Reelin receptors. However, levels of phosphorylated Dab1 are decreased in ITSN1 knockout mice indicating inefficient activation of the Reelin signaling pathway. Reelin fails to facilitate N-methyl-D-aspartate receptor (NMDAR) potentials in ITSN1 knockout mice and, as a result, cannot augment hippocampal long-term potentiation (LTP). These findings suggest that ITSN1 operates as a signaling adaptor for Reelin-VLDLR-Dab1 signaling. This notion is supported by mouse mutants deficient for the second main receptor for Reelin, apolipoprotein E receptor 2 (ApoER2). These ApoER2 knockout mice phenotypically resemble ITSN1 knockout mice, albeit in a more severe form, suggesting that the disruptions in the absence of ITSN1 are indeed a consequence of defective Reelin signaling. Simultaneous ablation of ITSN1 and ApoER2 (ITSN1/ApoER2 double knockout mice) aggravates the defects in hippocampal morphology and neurogenesis. In addition, ITSN1/ApoER2 double knockout mice also display disrupted layering of the cerebral cortex, similar to VLDLR/ApoER2 double knockout mice. These results imply that ITSN1 and ApoER2 act in distinct pathways transmitting the Reelin signal, in agreement with the biochemical data. Taken together, our results show that ITSN1 is a component of the Reelin signaling machinery downstream of the VLDLR. This finding provides insights into the mechanisms by which Reelin fulfills its various functions for the developing and mature brain. Furthermore, our results may have implications for a variety of neurological diseases, particularly Down syndrome and Alzheimer’s disease.

Intersectin1 (ITSN1) ist ein Multidomänen-Gerüstprotein, für das Funktionen im vesikulären Membranverkehr und bei zellulären Signalkaskaden vorgeschlagen wurden. Allerdings ist die funktionelle Bedeutung von ITSN1 in Säugetierorganismen noch nicht ausdiskutiert. Hier erbringen wir den Nachweis für eine bisher unbeschriebene Funktion von ITSN1. Mausmutanten, denen ITSN1 genetisch entfernt wurde (ITSN1 Knockout Mäuse), weisen eine normale Lebensfähigkeit auf und erscheinen äußerlich normal. Histologische Analysen der Gehirne von ITSN1 Knockout Mäusen offenbarten jedoch ausgeprägte Störungen im Hippocampus. In diesen Mäusen ist die hippocampale Schichtung aufgrund fehlerhafter Zellwanderung während der Entwicklung gestört. Darüber hinaus ist das Gerüst der radialen Gliazellen im Gyrus dentatus ungeordnet und neuronale Vorläufer ektopisch lokalisiert, was auf Defizite bei der adulten Neurogenese im Hippocampus hinweist. Der Aufbau des Cortex und des Cerebellums, die Neurogenese in der subventrikulären Zone (SVZ), die Morphologie dendritischer Dornen und die Ausbildung axonaler Kommissuren sind unverändert in Abwesenheit von ITSN1. Dies deutet darauf hin, dass ITSN1 spezifisch für Entwicklung und Funktion des Hippocampus benötigt wird. Mehrere zellbiologische und biochemische Experimente zeigten, dass die Veränderungen in ITSN1 Knockout Mäusen nicht die Folge von Mängeln im Transport oder der Signalweiterleitung von ephrinB/EphB-Proteinen sind, ein Signalweg, welcher zuvor mit ITSN1 in Verbindung gebracht wurde. Der Phänotyp der ITSN1 Knockout Mäuse wird vielmehr durch Fehler im Signalweg, welcher dem großen extrazellulären Glycoprotein Reelin nachgeschaltet ist, verursacht. Biochemische, elektrophysiologische und genetische Daten zeigen, dass ITSN1 spezifisch für die Weitergabe des Reelin- Signals durch einen seiner Hauptrezeptoren, den Very-low-density-lipoprotein Rezeptor (VLDLR), benötigt wird. ITSN1 ist physisch mit VLDLR und dem Reelin- Signal-Adapterprotein Disabled1 (Dab1) assoziiert. Trotz seiner beschriebenen Funktion als endozytisches Gerüstprotein, ist ITSN1 entbehrlich für den endozytischen Transport der Reelin-Rezeptoren. Die Menge an phosphoryliertem Dab1 ist jedoch verringert in ITSN1 Knockout Mäusen, was auf eine ineffiziente Aktivierung des Reelin-Signalwegs hinweist. Reelin gelingt es nicht, in ITSN1 Knockout Mäusen N-methyl-D-aspartate-Rezeptor (NMDAR)-Potentiale zu verstärken und es kann daher das Ausmaß der hippocampalen Langzeit-Potenzierung (LTP) nicht vergrößern. Diese Erkenntnisse legen den Schluss nahe, dass ITSN1 als Adapter für den Reelin-VLDLR-Dab1 Signalweg fungiert. Diese Vorstellung wird gestützt von Mausmutanten, denen der zweite Hauptrezeptor für Reelin, Apolipoprotein E Rezeptor 2 (ApoER2), fehlt. Diese ApoER2 Knockout Mäuse ähneln ITSN1 Knockout Mäusen phänotypisch, wenn auch in einer schwereren Ausprägung, was nahelegt, dass die Störungen in Abwesenheit von ITSN1 in der Tat die Folge eines fehlerhaften Reelin-Signalwegs sind. Die gleichzeitige Entfernung von ITSN1 und ApoER2 (ITSN1/ApoER2 Doppel-Knockout Mäuse) verschärft die Defekte hippocampaler Morphologie und Neurogenese. Darüber hinaus weisen ITSN1/ApoER2 Doppel-Knockout Mäuse eine fehlerhafte Schichtung des zerebralen Cortexes auf, ähnlich wie VLDLR/ApoER2 Doppel-Knockout Mäuse. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass ITSN1 und ApoER2 bei der Übertragung des Reelin-Signals in unterschiedlichen Signalwegen agieren, was im Einklang mit den biochemischen Daten steht. Zusammengefasst zeigen unsere Ergebnisse, dass ITSN1 eine Komponente der Maschinerie darstellt, die abhängig von VLDLR das Reelin-Signal weitergibt. Dieser Befund verschafft Einblicke in die Mechanismen, mit denen Reelin seine vielfältigen Funktionen für das sich entwickelnde und das reife Gehirn erfüllt. Des Weiteren könnten unsere Ergebnisse Folgen für eine Vielzahl an neurologischen Erkrankungen, im Besonderen Down-Syndrom und Alzheimer-Krankheit, haben.