Proteins mediating somatic hypermutation and class switch recombination at the immunoglobulin locus

Abstract

Summary Antibodies are produced by B cells before antigen contact. A given B cell synthesizes antibodies of one specificity only. However, the large number of B lymphocytes allows for a large diversity, which stands ready to meet the antigenic universe. Upon contact with the cognate antigen, the B cell expands into a clone and eventually secretes the antibody in large amounts. The diversity of antibodies is generated in two steps, first before antigen contact by random and imprecise joining of gene segments. Second, upon encounter with the antigen, three types of genetic changes in the antibody encoding loci may occur: somatic hypermutation (SHM) and gene conversion in the antigen binding part; and class switch recombination (CSR) in the non- antigen binding part of the antibody. All three phenomena are mediated by the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID), which is specifically expressed in activated B cells. WEHI-231 is known as an immature B cell line with no evidence for SHM or CSR. Indeed, in early freezings of the WEHI-231 line the canonical AID is absent. However, we found some variant lines that express AID. But despite the presence of AID and other known factors required for SHM and CSR, cells of the WEHI-231 variants do not switch the Ig class and hypermutate only at low level. This level, though, was enough in a subclone to cause decreased surface IgM via accumulation of mutations in the Κ light chain, which decreased  expression, and, in turn, decreased the amount of complete IgM on the cell surface. And instead of CSR, we found in a WEHI-231 variant recombination between alleles. In early WEHI-231 freezings, instead of the canonical AID, an 18-kD protein is expressed. The protein reacts with the antibody to AID, and therefore may represent a temporal precursor to functional AID. Based on the presence the 18-kD protein and expression of the mature B cell marker IgD, we re-classified WEHI-231 as a mature B cell line, and the WEHI-231 variants as activated B cell lines. We used the WEHI-231 lines to search for additional unknown factors required for SHM and CSR. By retroviral integration mutagenesis we found the chaperone Tid-1 as a potential missing factor. As a second candidate, we studied the chromatin-remodeling factor Supt6h, which is thought to help transcription by displacing histones for the RNA polymerase II to access the DNA. The rate of mutation introduced by AID depends on the rate of transcription, and so a transcription factor seemed to be a good choice after we had found previously that Supt6h binds AID in yeast two-hybrid screens.

Eine B-Zelle produziert Antikörper von nur einer bestimmten Spezifität. Da verschiedene B-Zellen verschiedene Antikörper produzieren, ermöglicht die hohe Anzahl von B-Zellen eine immense Antikörpervielfalt. Diese Vielfalt wird durch zwei genetische Mechanismen gewährleistet: zum Einen vor Antigenkontakt, durch zufälliges und unpräzises Zusammenfügen von Gensegmenten. Zum Anderen kann nach Antigenkontakt durch somatische Hypermutation (SHM) und Genkonversion die Antikörpervielfalt hinsichtlich der Spezifität erhöht werden, und durch Umschalten der Immunglobulinklasse (class switch recombination, CSR) kann der konstante Teil des Antikörpers ausgewechselt werden. Für die genannten Mechanismen ist das Enzym AID (activation-induced cytidine deaminase) notwendig, welches ausschliesslich in aktivierten B-Zellen exprimiert wird. Die Zelllinie WEHI-231 wird als Repräsentant einer unreifen B-Zelle angesehen. Sie sollte daher kein AID exprimieren und damit auch weder SHM noch CSR aufweisen. In der vorliegenden Arbeit wurden jedoch AID-exprimierende WEHI-231 Varianten gefunden: Obwohl AID vorhanden ist und auch die anderen in CSR und SHM involvierten Faktoren in den WEHI-231 Varianten unverändert exprimiert werden, konnte kein CSR und nur im geringen Maße SHM nachgewiesen werden. Eine Ausnahme ist ein Zellklon, der durch Akkumulation von Mutationen in der leichten Kette nur wenig IgM an der Zelloberfläche vorweist. Ein möglicher Hinweis auf fehlerhafte AID-Aktivität ist die Rekombination zwischen den Immunglobulin-Allelen, die in WEHI-231 vorgefunden wurde. Anstelle des klassischen AID-Proteins mit 24 kD Molekulargewicht wurde in der ursprünglichen WEHI-231-Linie ein Protein gefunden, das mit dem AID-Antikörper reagiert, aber nur 18 kD Molekulargewicht hat. Aufgrund dieser Ergebnisse und der Tatsache, dass auch IgD exprimiert wird, wurde WEHI-231 als reife B-Zelllinie und die WEHI-231-Variante als aktivierte B-Zelllinie reklassifiziert. Um weitere Faktoren für SHM und CSR zu finden, wurde SHM in der WEHI-231-Variante mittels retroviraler Integration induziert und als potentieller Kandidat das Chaperon Tid-1 gefunden. Als ein weiterer AID- Interaktionspartner wurde der chromatin-modulierende Faktor Supt6h untersucht, welcher zuvor als potentieller AID-Interaktionspartner in einem yeast two- hybrid test identifiziert wurde. Supt6h bewirkt das Entfernen und späteres Wiedereinfügen von Histonen während der Transkription der RNA Polymerase II. Da die AID-induzierte Mutationsrate von der Transkriptionsrate abhängt, wurde unter der Annahme, dass Supt6h ein vielversprechender Kandidat ist, Interaktion mit AID verifiziert.