The IgCAM CAR regulates calcium homeostasis in the developing heart

Abstract

The coxsackie- and adenovirus receptor (CAR) is a cell adhesion protein of the Ig superfamily which serves as receptor for different coxsackie- and adenoviruses. CAR is strongly expressed throughout the developing heart and in contrast, during adulthood CAR is concentrated found at the intercalated discs. CAR knockout mouse models show malformation of the heart which leads to death between embryonic days E11.5 and E12.5 indicating an important function of CAR during heart development. Conditional CAR KO mouse models revealed impairment during excitation conduction in the mature heart. The aim of this study was to investigate the physiological function of CAR during early heart beats with regard to intercellular communication and Ca2+ cycling in embryonic cardiomyocytes. By using a global CAR KO mouse model, the investigation of cultivated E10.5 CAR KO cardiomyocytes and E11 CAR KO hearts revealed a significant higher beating frequency. Calcium imaging recordings of spontaneous Ca2+ transients in CAR KO cardiomyocytes showed a significant faster systolic Ca2+ decline compared to wt. The analysis of the cardiac Ca2+ extrusion mechanisms revealed a higher activity for NCX and SERCA2 in CAR KO cardiomyocytes. Gene expression and protein level of both NCX and SERCA2 was not changed in CAR KO hearts. Dye spreading studies with lucifer yellow indicated increased cell coupling of cultivated E10.5 CAR KO cardiomyocytes. Further, a significant reduction of the cell size of the CAR KO cardiomyocytes was found in culture and in embryonic heart sections. Cx45 expression was downregulated in CAR KO hearts, however the observed increased cell coupling suggested in CAR KO hearts a remodelling of gap junctions that increases intercellular communication and excitation conduction resulting in the increased embryonic heart beat as recorded for CAR KO embryos. Due to the strong coexpression with Cx43 and Cx45 it can be suggested that CAR is localised in a larger protein complex involved with ZO-1 at the junctional sites. There, CAR may promote correct localisation of Cx45 and ZO-1 and cell- to-cell coupling. Taken together, CAR regulates intercellular communication between embryonic cardiomyocytes, is able to influence spontaneous Ca2+ cycling and is therefore an important regulator for embryonic heart beating.

Der Coxsackie- und Adenovirusrezeptor (CAR) ist ein Zelladhäsionsmolekül aus der Superfamilie der Immunglobuline, welches als Rezeptor für verschiedene Coxsackie- und Adenoviren entdeckt wurde. Weitere Untersuchungen zeigten, dass CAR sehr stark während der embryonalen Entwicklung des Herzens exprimiert wird. Hingegen wird CAR in adulten Herzen vorwiegend in den Glanzstreifen zwischen benachbarten Kardiomyozyten gefunden. CAR KO Mausmodelle zeigen starke Herzentwicklungsfehler, welche zwischen Entwicklungsstufe E11.5 und E12.5 zum Tode der betroffenen Embryonen führen und darauf hindeuten, dass CAR eine bedeutende Funktion während der Entwicklung des Herzen hat. Bei Untersuchungen von konditionellen CAR KO Mausmodellen wurde eine Beeinträchtigung der Erregungsweiterleitung im adulten Herzen beobachtet. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, inwiefern CAR das spontane Schlagen des embryonalen Herzens in Hinblick auf intrazelluläres Ca2+ und Zell-Zell Kommunikation beeinflusst. Dazu wurde ein globales CAR KO Mausmodell verwendet, welches für kultivierte E10.5 CAR KO Kardiomyozyten sowie für E11 CAR KO Herzen eine signifikant erhöhte spontane Schlagfrequenz aufzeigte. Bei Messungen von spontanen Ca2+ Transienten in CAR KO Kardiomyozyten wurde eine schnellere systolische Ca2+ Abnahme beobachtet im Gegensatz zu den deutlich langsameren Ca2+ Abnahmen im wt Kardiomyozyten. Die weitere Analyse von systolischen Ca2+ Abbaumechanismen zeigte eine höhere Aktivität für NCX und SERCA2 in CAR KO Kardiomyozyten. Die Genexpression sowie die gemessene Proteinmenge war jedoch für NCX und SERCA2 nicht verändert. Die Beobachtung von lucifer yellow Diffusion zwischen benachbarten Kardiomyozyten machte für CAR KO Kardiomyozyten eine stärkere Verbreitung des Farbstoffes deutlich, was auf eine bessere Zell-Zell Kommunikation deutet. Außerdem wurde eine geringere Zellgröße in kultivierten CAR KO Kardiomyozyten und in Gewebeschnitten der embryonalen CAR KO Herzen gefunden. Des Weiteren ist die Expression von Cx45 herunter reguliert, wobei die erhöhte Zell-Zell Kommunikation zwischen CAR KO Kardiomyozyten auf eine Veränderung und Remodellierung der Connexine und gap junctions hinweist, die wiederum eine verstärkte Interaktion und Erregungsweiterleitung zwischen den Kardiomyozyten induziert und dadurch die Schlagfrequenz erhöht. Die beobachtete Ko-expression von CAR mit Cx43 und Cx45 unterstützt die Annahme, dass CAR in einen größeren Proteinkomplex zusammen mit Cx43, Cx45 und ZO-1 involviert ist und dieser an Zell-Zell-Kontakten lokalisiert ist. In diesem Proteinkomplex könnte CAR die korrekte Lokalisierung von Cx45 und ZO-1 fördern und somit die Erregungsweiterleitung und interzelluläre Kommunikation unterstützen. Zusammenfassend, CAR reguliert die Interaktion und Kommunikation zwischen benachbarten Kardiomyozyten im embryonalen Herzen, beeinflusst dadurch die spontanen Ca2+ Transienten und ist somit möglicherweise ein weiterer Regulator für das embryonale Herzschlagen.