Expressionsanalyse und funktionelle Charakterisierung der AP-1-Faktoren BATF und BATF3 im anaplastischen großzelligen Lymphom

Abstract

Das anaplastische großzellige Lymphom (ALCL) gehört zur Gruppe der T-Zell Non-Hodgkin-Lymphome und tritt in zwei systemischen Formen auf, dem anaplastic lymphoma kinase (ALK) -positiven (ALK+) und ALK-negativen (ALK-) ALCL. ALK+ ALCL haben in der Regel eine gute Prognose und treten im jüngeren Alter auf, wohingegen das ALK- ALCL vermehrt bei älteren Patienten auftritt und eine schlechtere Prognose hat. Neben einer typischen Zellmorphologie bestehend aus großen, pleomorphen Zellen ist die Expression des Zelloberflächenmarkers CD30 typisch für das ALCL. Zellen des ALCL sind darüberhinaus durch ein spezifisch dereguliertes Netzwerk von Transkriptionsfaktoren gekennzeichnet. Hierzu gehören eine konstitutive Aktivität des activator protein 1 (AP-1)-Transkriptionsfaktorkomplexes sowie des interferon regulatory factor 4 (IRF4), die beide Wachstum und Überleben der ALCL-Zellen fördern. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den AP-1-Komplex in ALCL-Zellen besser zu charakterisieren und insbesondere Expression und Funktion der AP-1-Faktoren BATF und BATF3 zu charakterisieren. In der vorliegenden Arbeit wurde zuerst die Expression von BATF und BATF3 in ALCL-Zelllinien und primären Patientenproben untersucht und eine differentielle Expression beider Faktoren im ALCL nachgewiesen, die, abgesehen vom klassischen Hodgkin-Lymphom, so in keiner anderen Lymphomentität vorkommt. Des Weiteren konnte eine starke Bindung von BATF und BATF3 an klassische AP-1-Bindungsmotive sowie AP-1/IRF-composite elements (AICE) gezeigt werden. Diese Bindungsaktivitäten unterscheiden das ALCL von anderen Lymphomen. Funktionell führte die Herunterregulation von BATF und BATF3 in ALCL-Zellen mittels siRNA-Interferenz zu einer starken Wachstumshemmung sowie Zelltodinduktion. Ebenso wurde ein Tetrazyklin-induzierbares System zur globalen Inhibition der AP-1-Aktivität durch den dominant-negativen Inhibitor A-Fos etabliert, was ebenfalls zu Wachstumsarrest und Zelltod führte. Weiterhin konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass durch das Zusammenspiel von BATF, BATF3 und IRF4 in ALCL-Zellen TH17- und type 3 innate lymphoid (ILC3-)Zell-typische Gene aktiviert werden. Neben Zytokinen wie IL-17 und IL-22 wurde eine ALCL-spezifische Expression von RORC2 identifiziert, der als einer der Schlüsselfaktoren für die TH17-/ILC3-Zelldifferenzierung gilt. Die pharmaklogische Inhibition von RORC2 sowohl alleinig als auch in Kombination mit dem ALK-Inhibitor Crizotinib hemmte das Wachstum von ALCL-Zellen. Zusammenfassend konnte diese Arbeit eine zentrale Bedeutung von BATF-Faktoren für die ALCL-Pathogenese beschreiben und die Möglichkeit aufzeigen, TH17/ILC3-assoziierte Gene als therapeutische Zielstruktur im ALCL zu nutzen.

Anaplastic large cell lymphoma (ALCL) belongs to the group of T-cell non-Hodgkinlymphoma and has two systemic subtypes, the ALK-positive and ALK-negative ALCL. Whereas the first form has its incidental peak at a younger age and a better outcome, the ALK-negative afflicts mainly older patients and has a worse overall survival. The hallmarks of ALCL cells are large, pleomorphic cells and the expression of the cell surface marker CD30. Belonging to the hematopoietic malignancies it is characterized by another feature of this group, a dysregulated network of transcription factors. So far, it was shown that ALCL has a constitutive activity of the transcription factor complex AP-1 and a high expression of the transcription factor IRF4, which is essential for growth and survival of ALCL. The aim of this work was to better-characterize the AP-1-complex and to identify the biological function of the AP-1-proteins BATF and BATF3. Therefore, the expression pattern of both proteins were analyzed in ALCL-cell lines and patient-derived primary material. A distinct differential expression of both proteins could be validated as well as their participation in the DNA-binding at classical AP-1-binding sites. Furthermore, it was shown that in ALCL-unknown AP-1/IRF-composite elements are co-occupied by complexes of IRF4 and AP-1 comprised of BATF and BATF3 separating ALCL from other hematological malignancies. To further characterize the biological function of BATF and BATF3 different technical approaches were used. Genomic deletion via CRISPR/Cas9 as well as gene-specific transient mRNA-interference lead to growth inhibition and cell death of ALCL-cells. In addition, global inhibition of the AP-1-activity showed a similar result. Furthermore, BATF and BATF3 drive a gene expression that resembles the gene signature of TH17- or type 3 innate lymphoid (ILC3) cells leading to the hypothesis that a fraction of ALCL might originate from ILC3. Pursuing this the expression of characteristic TH17-/ILC3-genes was shown in ALCL-cell lines and primary material including the expression of the key transcription factor of TH17-/ILC3-differentiation RORC2. Finally, pharmacological inhibition of RORC2 using a small molecular inhibitor alone or in combination with the ALK-antagonist crizotinib lead to growth retardation of RORC2-expressing ALCL cells. This work demonstrated the essential function of BATF and BATF3 for ALCL and its role for the establishment of newly detected ILC3-gene signature, which could be a hint for the origin of ALCL.