Hintergrund: Calcineurin-Inhibitoren wie Cyclosporin A (CsA) sind klinisch relevante und effektive Immunsuppressiva, aber neurologische Nebenwirkungen, beispielsweise zerebrale Krampfanfälle, limitieren ihr therapeutisches Potenzial. Die zugrundeliegenden Pathomechanismen sind nicht hinreichend charakterisiert. Für die Regulation neuronaler Erregbarkeit ist die intrazelluläre Chloridkonzentration ([Cl-]i) von entscheidender Bedeutung, da sie die Stärke und Polarität der GABAergen Transmission determiniert. Sekundär aktive Kationen- Chlorid-Kotransporter wie der K+-Cl- Kotransporter 2 (KCC2) und der Na+-K+-2Cl- Kotransporter 1 (NKCC1) bestimmen die [Cl-]i. Phosphorylierung durch with-no-lysine Kinasen (WNKs) und die STE20/SPS1-related kinase (SPAK) inhibiert den Cl--Exporter KCC2, aber aktiviert den Cl--Importer NKCC1. In der Niere wird die WNK-SPAK-Kaskade durch Calcineurin supprimiert. Diese Arbeit verfolgt die Hypothese, dass Calcineurin ebenfalls als endogener Regulator des WNK-SPAK-Signalweges im zentralen Nervensystem fungiert und pharmakologische Calcineurin-Inhibition in neuronaler Cl--Akkumulation und Übererregbarkeit resultiert.
Methoden: CsA-abhängige Effekte auf die neuronale Cl--Homöostase wurden ex vivo in kortikalen Hirnschnitten der Wistar-Ratte mittels intrazellulärer Ableitungen und Messungen der 2-Photonen-Fluoreszenz-Lebenszeit des Cl--Sensors MQAE untersucht. Durch Immunpräzipitation wurden physische Interaktionen zwischen WNK2, SPAK, Calcineurin und KCC2 bzw. NKCC1 evaluiert. Effekte akuter und chronischer CsA-Applikation auf Expression, Abundanz und Phosphorylierung dieser Produkte wurden im Gehirn der Wistar-Ratte durch Immunhistochemie, qPCR und Western Blot charakterisiert. Korrelativ wurden Western Blots aus Calcineurin A Beta(CnAB)- sowie SPAK-defizientem Hirngewebe der Maus angefertigt.
Ergebnisse: Die Applikation von CsA (10 μM, 1 h) führte zu einer verlängerten Cl--Extrusionszeit und gesteigerten [Cl-]i in kortikalen Pyramidenzellen. Zwischen Calcineurin, WNK2, SPAK und KCC2/NKCC1 konnten multiple Protein-Protein-Interaktionen nachgewiesen werden, die die Ausbildung eines multimolekularen Komplexes um WNK2 als Scaffold suggerierten. Die intraperitoneale CsA-Gabe (25 mg/kg KG, 1 h oder 14 d) führte kurzfristig zur Steigerung der aktivierenden S383-SPAK- Phosphorylierung sowie der inhibitorischen, SPAK-abhängigen T1007-KCC2-Phosphorylierung. Auch die inhibitorische KCC2-Tyrosinphosphorylierung war erhöht. Durch chronische CsA-Applikation steigerten sich S383-SPAK- und T1007-KCC2- Phosphorylierung ebenfalls. Zusätzlich zeigte sich eine Reduktion der aktivierenden S940-KCC2-Phosphorylierung und Steigerung der NKCC1-Abundanz. In CnABeta-defizienten Mäusen konnten diese Ergebnisse reproduziert werden, während sich in SPAK-defizienten Mäusen reziproke Veränderungen zeigten.
Schlussfolgerung: Diese Arbeit etabliert die Phosphatase Calcineurin als endogenen Regulator der SPAK-Aktivität im zentralen Nervensystem von Nagetieren. Die pharmakologische Calcineurin-Inhibition mit CsA aktiviert den WNK-SPAK-Signalpfad. Dies resultiert in vermehrter hemmender KCC2- und aktivierender NKCC1-Phosphorylierung, was wiederum zu intrazellulärer Cl-Akkumulation und neuronaler Übererregbarkeit führt. Aus diesem neuen Mechanismus der KCC2-Regulation durch Calcineurin ergeben sich translationale Perspektiven für die Behandlung der CsA-vermittelten Neurotoxizität und epileptischer Erkrankungen mit SPAK-Inhibitoren.
Calcineurin Inhibitors, like cyclosporine A (CsA), are clinically relevant and efficacious immunosuppressive agents, but neurologic side effects, such as seizures, limit their therapeutic potential. Their underlying pathomechanisms are characterized insufficiently. The intracellular chloride concentration [Cl-]i is crucial for the regulation of neuronal excitability because it determines strength and polarity of GABAergic transmission. Secondary active cation-coupled chloride cotransporters like the K+-Cl- co-transporter 2 (KCC2) and the Na+-K+-2Cl- co-transporter 1 (NKCC1) adjust [Cl-]i. Phosphorylation by with-no-lysine kinases (WNKs) and the STE20/SPS1-related kinase (SPAK) inhibits the chloride exporter KCC2, but activates the chloride importer NKCC1. In the kidney, calcineurin suppresses the WNK-SPAK cascade. This thesis tests the hypothesis that calcineurin similarly acts as an endogenous regulator of WNK-SPAK signaling in the central nervous system. Pharmacologic calcineurin inhibition thus should result in neuronal chloride accumulation and hyperexcitability. Methods: CsA-induced effects on neuronal chloride homeostasis were investigated ex vivo in cortical Wistar rat brain slices, deploying intracellular recordings and Two-Photon Fluorescence Lifetime Imaging with the chloride sensor MQAE. Using co-immunoprecipitation, physical interactions between WNK2, SPAK, calcineurin and KCC2 or NKCC1 were characterized. Effects of acute and chronic application of CsA on expression, abundance and phosphorylation of these products were evaluated by immunohistochemistry, RT-PCR and western blot. For correlation, western blots were performed in calcineurin A(CnA)- and SPAK-deficient mouse brain. Results: Application of CsA (10 μM, 1 h) lead to a prolongation of chloride extrusion time and raised [Cl-]i in cortical pyramidal neurons. Multiple interactions were detected between WNK2, SPAK, calcineurin, and KCC2 or NKCC1, suggesting the formation of a multimolecular complex around WNK2 as scaffold. Intraperitoneal application of CsA (25 mg/kg, 1 h or 14 d) raised the activating S383-SPAK phosphorylation and the inhibitory, SPAK-dependent T1007-KCC2 phosphorylation. Additionally, the inhibitory KCC2 tyrosine phosphorylation was elevated short term whereas a reduction of the activating S940-KCC2 phosphorylation and increased NKCC1 abundance were present in the long term. These results were reproduced in CnA-deficient mice while SPAK-deficient mice showed reciprocal changes. Conclusion: This study establishes the phosphatase calcineurin as endogenous regulator of SPAK activity in the rodent central nervous system. Pharmacologic inhibition of calcineurin by CsA activates the WNK-SPAK-signaling pathway. This results in increased inhibitory KCC2 phosphorylation and activating NKCC1 phosphorylation, thus leading to intracellular chloride accumulation and neuronal hyperexcitability. Translational perspectives for therapeutic management of CsA-induced neurotoxicity and epileptic disorders can be derived from this mechanism in the form of pharmacological SPAK inhibition.
