Mechanismen der zielgerichteten antitumoralen Wirksamkeit von Dianthin-Panitumumab-Konjugaten in Kombination mit dem glykosylierten Triterpenoid SO1861

Abstract

Die stets ansteigende Zahl an Krebserkrankungen mit einhergehendem tödlichem Verlauf erfordert die stetige Weiter- und Neuentwicklung von entsprechenden Therapien, welche Tumorspezifisch agieren müssen. Vor allem schwerwiegende Nebeneffekte, die häufig bei den gängigen Radio- und Chemotherapien auftreten, gilt es zu minimieren. Der Aufbau von Antikörper-Wirkstoff-Konjugaten (ADC) vereint hier das zielgerichtete Wirken durch den Antikörper mit der Toxizität der Wirkstoffkomponente und so sind bereits acht dieser ADCs durch die Food and Drug Administration zugelassen worden. In dieser Arbeit wurde deswegen ein ADC aus Panitumumab, einem vollständig humanen IgG2-Antikörper mit geringem immunogenem Potential, und Dianthin, einem hoch toxischen pflanzlichen und enzymatisch wirkenden Protein, reproduzierbar mit einem Wirkstoff-zu-Antikörper-Verhältnis (DAR) von ~1 und einer molekularen Masse von ~180 kDa erzeugt. Dabei wurde die Bindungsaffinität von Dianthin-Panitumumab (DPan) zum Zielrezeptor EGFR, welcher vorwiegend von Krebszellen in einem Übermaß exprimiert wird, unvermindert gegenüber Panitumumab mit einem KD-Wert von 1.5 × 10^-10 M bestimmt. Die enzymatische Aktivität von DPan im Vergleich zu Dianthin war aufgrund der Kopplung um ~50 % von 312.2 auf 153.3 pmol(Adenin)/pmol(Protein)/h vermindert, jedoch bewies das ADC DPan in vitro ein enormes selektives und zielzellspezifisch zytotoxisches Potential, wobei in Kombination mit dem glykosylierten Triterpenoid SO1861 als Endosomal Escape Enhancer eine bemerkenswerte mittlere Effektivität von 0.00022 / 0.00006 nM (IncuCyte-Echtzeitmessung / MTT-Assay) erreicht wurde. Das zytotoxische Potential der Kombinationsbehandlung konnte weiterführend in einem 3D-Sphäroid-Versuch unter realitätsnahen Tumorbedingungen nachgewiesen werden. Ebenso konnte in dieser Arbeit erstmals gezeigt werden, dass DPan weiterhin und vergleichbar zu Panitumumab in der Lage ist, die Antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität (ADCC) über PBMCs und Monozyten auszulösen, um somit einen additiven antitumoralen Effekt zu erzeugen. Das in vitro hervorragend zytotoxisch wirkende ADC DPan zeigte dagegen in vivo an tumortragenden Mäusen eine im Vergleich zu Panitumumab leicht verminderte antitumorale Wirkung, wobei in Kombination mit SO1861 die Wirkung signifikant gesteigert wurde. Die eingesetzte Dosis mit 3.3 µg lag dabei weit unter der höchst verträglichen Dosis ohne schwerwiegende Nebeneffekte mit 126 µg. Untersuchungen der Biodistribution von Radionuklid (99mTc) markierten DPan und Panitumumab zeigten indes eine unterschiedliche Kinetik. Beide Proteine zeigten bezüglich der Konzentration im Tumor erst am Ende des untersuchten Zeitraums von 18 h die höchste Konzentration , wobei Panitumumab dominierend im Tumor akkumulierte. Die allgemeine Biodistribution im Körper betrachtend zeigte Panitumumab eine vermehrte Plasmapräsenz im Blut-Pool, wohingegen DPan stark in der Leber und Milz akkumulierte. Ferner konnte gezeigt werden, dass Dianthin bereits im Blutplasma geringfügig aus dem ADC abgespalten wird, vermutlich weil hier ein spaltbarer SPDP-Linker verwendet wurde. Da DPan in Kombination mit SO1861 aber in vitro ein hervorragendes antitumorales Potential zeigte, welches in vivo nicht gänzlich zum Tragen kam, sollte trotzdem in zukünftigen Arbeiten an der Optimierung der In-vivo-Effizienz von DPan gearbeitet werden.

The ever-increasing number of cancers with a fatal outcome requires the constant further and new development of appropriate therapies, which have to act tumor-specific. Above all, serious side effects, which frequently occur with current radio- and chemotherapies, must be minimized. The development of antibody-drug conjugates (ADCs) combines the targeted action of the antibody with the toxicity of the drug component, and eight of these ADCs have already been approved by the Food and Drug Administration. In this work, an ADC was therefore generated from panitumumab, a fully human IgG2 antibody with low immunogenic potential, and dianthin, a highly toxic plant and enzymatically active protein, reproducibly with a drug to antibody ratio (DAR) of ~1 and a molecular mass of ~180 kDa. The binding affinity of dianthin-panitumumab (DPan) to the target receptor EGFR, which is predominantly expressed by cancer cells in excess, was determined undiminished compared to panitumumab with a KD value of 1.5 × 10^-10 M. The enzymatic activity of DPan compared to dianthin was reduced by ~50% from 312.2 to 153.3 pmol(adenine)/pmol(protein)/ due to coupling. But the ADC DPan demonstrated an enormous selective and target cell specific cytotoxic potential in vitro. In combination with the glycosylated triterpenoid SO1861 as an endosomal escape enhancer, a remarkable mean effectiveness of 0.00022 / 0.00006 nM (IncuCyte real-time measurement / MTT assay) was achieved. The cytotoxic potential of the combination treatment was further demonstrated in a 3D-spheroid experiment under realistic tumor conditions. In this work it could also be shown for the first time that DPan is still able to induce antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) via PBMCs and monocytes in a manner comparable to panitumumab, thus producing an additive anti-tumor effect. In contrast, the in vitro outstanding cytotoxicity of ADC DPan showed in vivo in tumor-bearing mice a slightly decreased antitumor effect compared to panitumumab, whereas in combination with SO1861 the effect was significantly increased. The applied dose of 3.3 µg was far below the highest tolerated dose of 126 µg and no serious side effects were observed. Investigations of the biodistribution of radionuclide (99mTc) labeled DPan and Panitumumab showed different kinetics. Both proteins showed the highest concentration in the tumor only at the end of the investigated period of 18 h, with panitumumab accumulating predominantly in the tumor. Regarding the general biodistribution in the body, panitumumab showed an increased plasma presence in the blood pool, whereas DPan accumulated strongly in the liver and spleen. Furthermore, it was shown that dianthin is already slightly cleaved from ADC in the blood plasma, presumably because a cleavable SPDP linker was used. However, since DPan in combination with SO1861 showed an excellent antitumor potential in vitro, which did not fully materialize in vivo, future work should nevertheless focus on optimizing the in vivo efficiency of DPan.