Recombinant Fusion proteins for Antibody-Directed-Enzyme-Prodrug-Therapy (ADEPT) in colon cancer: Recombinant single-chain fusion proteins

Abstract

Antibody-directed enzyme prodrug therapy (ADEPT) is an approach to improve the specificity of anti-tumor chemotherapy by way of artificial antibody-enzyme constructs targeted at tumor cells. This allows for the selective conversion of a non-toxic prodrug into a cytotoxic agent localized to the tumor site. Applying this strategy on colon cancer, we chose A33 as the antibody component, which recognizes the differentiation antigen gpA33. A novel member of the immunoglobulin family, gpA33 is expressed by > 95 % of human colon cancers, but is absent in all non-gastrointestinal tissues, making it a promising target for ADEPT. Little is known about the characteristics of the A33 antigen with regard to cell growth and cell cycle as well as the respective impact on antigen expression. In an attempt to elucidate the gpA33 function, here we have investigated the dependence of surface gpA33 presence on cell growth kinetics and visualized internalization in living cells. Along with the elucidation of the gpA33 function we also aimed to develop bispecific fusion proteins which at the same time are capable of recognizing the gpA33 and have either a diagnostic or a therapeutic effector function. The design, cloning, expression and functional assaying of two recombinant fusion constructs based on an anti-gpA33 single chain fragment, termed A33scFv, is described here. The first construct, A33scFv::GFP, carries the fluorophore green fluorescent protein and has been designed as a model construct for biodistribution and cell biology studies of gpA33. The other, A33scFv::CDy, has been designed for ADEPT and carries the enzyme cytosine deaminase from the yeast S. cerevisiae (CDy) as effector protein, which converts 5-fluorocytosine (5-FC) into the approved chemotherapeutic drug 5 fluo¬ro¬uracil (5-FU). The A33scFv::GFP allowed the quantitative demonstration of specific binding in vitro and in vivo. Using this reagent as a tool, we showed that the expression of A33 on the membrane of colorectal cancer cells was influenced by cell density and is cell cycle dependent in a pattern distinct from that of housekeeping genes. The “therapeutic” protein A33scFv::CDy demonstrated dual function, i.e. antibody binding and enzyme activity, and was successfully applied in the complete ADEPT system in vitro, resulting in a 300-fold increase in the toxicity of the substrate, 5-FC, on gpA33-positive cell lines, but not on gpA33-negative controls.

Die antikörpervermittelte Enzym-Prodrug-Therapie (englisch antibody-directed enzyme-prodrug therapy, ADEPT) ist ein Ansatz, die Spezifität onkologischer Chemotherapien durch künstliche auf Tumorzellen gerichtete Antikörperenzymkonstrukte zu verbessern. Dies ermöglicht die selektive Umwandlung einer ungiftigen Prodrug in eine im Tumorgewebe lokalisierte zytotoxische Substanz. Wir wendeten diese Strategie bei Kolonkarzinom an, indem wir A33 als Antikörperkomponente verwendeten, welche das Differenzierungsantigen gpA33 erkennt. GpA33s gehört zur Immunglobulin- Superfamilie und wird von > 95 % aller Kolonkarzinome exprimiert. Da es in nicht gastrointestinalem Gewebe nicht vorkommt stellt es ein viel versprechendes Ziel der ADEPT dar. Über die Merkmale des A33 Antigens bezüglich Zellwachstum und Zellzyklus sowie die jeweilige Wirkung auf die Antigenexpression ist wenig bekannt. Um die Funktion des gpA33 zu beschreiben haben wird die Zellwachstumskinetik in Abhängigkeit von der Anwesenheit von gpA33 untersucht und die Aufnahme in lebende Zellen visualisiert. Neben der Untersuchung der Funktion des gpA33 ging es uns darum, bispezifische Fusionsproteine zu entwickeln, welche in der Lage sind, gpA33 zu erkennen, und gleichzeitig diagnostische oder therapeutische Funktion innehaben. Hier werden die Struktur, die Klonierung, die Expression und die funktionelle Prüfung von zwei rekombinanten Fusionskonstrukten beschrieben, welche auf einem anti-gpA33 Einzelketten-Fragment, A33scFv genannt, basieren. Das erste Konstrukt, A33scFv::GFP, trägt das grün-fluoreszierende Eiweiß GFP (green fluorescent protein) und wurde als Musterkonstrukt für Biodistribution und zellbiologische Studien des gpA33 entworfen. Das andere, A33scFv::CDy, wurde für ADEPT entworfen und ist Träger des Enzyms Cytosindesaminase aus der Hefe S. cerevisiae (CDy). Es fungiert als Effektorprotein welches 5-Fluorocytosin (5-FC) in das als Chemotherapeutikum zugelassene 5-Fluorouracil (5-FU) umwandelt. A33scFv::GFP ermöglichte eine quantitative Demonstration spezifischer Bindungen in vitro und in vivo. Indem wir das Reagens als Werkzeug verwendeten, konnten wir zeigen, dass die Expression des A33 auf der Membran kolorektaler Karzinomzellen unabhängig von der Expression von Haushaltsgenen durch die Zelldichte beeinflusst wurde und vom Zellzyklus abhängig war. Das "therapeutische" Fusionsprotein A33scFv::CDy zeigte zweifache Funktion, d.h. Antikörperbindung und Enzymaktivität, und konnte in vitro erfolgreich im kompletten ADEPT System angewandt werden. Dies führt zu einer 300fachen Steigerung der Toxizität des Substrats 5-FC auf gpA33 positive Zelllinien, jedoch nicht auf gpA33 negative Kontrollen.