Studies into the function and regulation of SHIP

Abstract

The 145 kDa protein, SHIP, is a hemopoietic-restricted negative regulator of the PI3-Kinase pathway and plays a central role both in hemopoiesis and the activation of innate immune cells. Our goal in this thesis was to extend the well established role that SHIP plays in BMMC development and activation to other MC subsets. We found that SHIP affected MC properties in many different ways. For example, in the absence of SHIP, MCs generally matured more quickly and were more prone to degranulation. Interestingly, survival in the absence of growth factors was not affected by SHIP in most MC subsets but, in the presence of IgE, WT BMMCs survived far better than SHIP-/- BMMCs. However, there was no difference between WT and SHIP-/- MMCs. In addition, SHIP appeared to be a positive regulator of TLR-mediated cytokine production and a negative regulator of FcεR1-mediated activation. However, in WT BMMCs there was synergy between TLR and FcεR1 activation, which was not seen in WT MMCs, suggesting that even MCs from the same subset can acquire distinct properties during their differentiation. Also, the synergistic effects were the strongest in SHIP-/- cells, indicating an important role for SHIP in the integration and processing of different signals. We also found that SHIP was a potent negative regulator of IL-4 production. However, this likely was of more importance in basophils than MCs. Since SHIP activity is regulated in large part by its protein levels and since several cancers down-regulate SHIP to increase their survival we also explored how SHIP protein levels are down-regulated. Our studies with inducible BCR-ABL expressing cells and with IL-4-induced BMmacs, revealed that SHIP was degraded through the proteasome since treatment with the proteasome inhibitor MG-132 prevented SHIP protein levels from declining. We also found that the ubiquitin ligases Cbl and Cbl-b interacted with SHIP, suggesting they are involved in ubiquitinating SHIP. Studies in which we lysed BMmacs with non-ionic detergents revealed that SHIP was “set up” for rapid proteasomal degradation since MG-132 prevented lysis-induced SHIP degradation. Tyrosine phosphorylation of SHIP seemed to be required for its breakdown in both cell systems since its degradation was prevented by inhibiting Src kinases with PP2. Also, at least in BCR-ABL expressing cells, there was a strong inverse relationship between total and phosphorylated SHIP protein levels. We also found that induction of SHIP degradation required Stat6 signalling, at least in IL-4 treated BMmacs, since this effect was abrogated in Stat6-/- BMmacs. Thus, in this study we confirmed SHIP’s central role in MC development and FcεR1-mediated activation and extended these studies to TLR- mediated activation. We also identified key factors involved in inducing and mediating SHIP breakdown. This might be important in designing new therapeutic strategies that exploit SHIP’s central role in regulating immune responses.

Das hämatopoetisch exprimierte Protein SHIP ist ein negativer Regulator des PI3-Kinase Signalweges und ein wichtiger Regulator der Blutzellenbildung sowie der Aktivierung von Zellen des angeborenen Immunsystems. Ein Ziel dieser Arbeit war es, die gut erforschte Rolle von SHIP in primären, vom Knochenmark (bone marrow, BM) differenzierten Mastzellen (MCs) auch in anderen MCmodellen zu analysieren. Es konnte gezeigt werden, dass SHIP die Eigenschaften von MCs auf verschiedene Art und Weise prägt. SHIP erwies sich als ein negativer Regulator der Differenzierung und Degranulierung von MCs, hatte aber keinen signifikanten Einfluss auf das Überleben von MCs in der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren. Für die TLR Aktivierung war SHIP ein positiver und für die FcεR1 Aktivierung ein negativer Regulator. In BMMCs and MMCs, zwei verschiedenen Modellsystemen für den gleichen MCsubtyp, wurden zuweilen auch unterschiedliche Einflüsse von SHIP beobachtet. Dies könnte darauf Hinweisen, dass MCs vom gleichen Subtyp während ihrer Differenzierung unterschiedliche Eigenschaften erlangen können. SHIP hatte auch einen negativen Effekt auf die IL-4 Synthese, was aber wichtiger in Basophilen zu sein schien. SHIPs Phosphataseaktivität wird überwiegend durch dessen Expressionslevel reguliert, und einige Krebsarten regulieren SHIP herunter, um sich dadurch einen Überlebensvorteil zu verschaffen. Daher war es eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit, mechanistische Einblicke, die zur Runterregulierung von SHIP führen, zu erlangen. Es konnte sowohl in BCR-ABL exprimierenden Ba/F3 Zellen, als auch in IL-4 behandelten, vom BM differenzierten, Makrophagen (BMmacs) gezeigt werden, dass SHIP durch das Proteasom abgebaut wird. Dieser Abbau wurde durch den Proteasominhibitor MG-132 unterdrueckt. Die Ubiquitinligasen Cbl und Cbl-b wurden als Kandidaten für die Ubiquitinierung von SHIP identifiziert. Lysierungsexperimente mit nichtionischen Detergenzien in BMmacs zeigten, dass SHIP sehr rapide durch das Proteasom abgebaut werden kann, da dies ebenfalls durch MG-132 inhibiert wurde. SHIPs Tyrosinphosphorylierung wurde in beiden untersuchten Zellsystemen als essentiell für dessen Abbau identifiziert, da der Src Kinaseinhibitor PP2 SHIPs Phosphorylierung und Abbau inhibierte. Zudem wurde in BCR-ABL exprimierenden Ba/F3 Zellen eine disproportionale Beziehung zwischen absoluten und phosphorylierten SHIP beobachtet. In BMmacs wurde der Stat6 Signalweg als essentiell für den IL-4 induzierten SHIP Abbau identifiziert. Im Rahmen dieser Arbeit haben wir die wichtige Funktion von SHIP in der Entwicklung und FcεR1 induzierten Aktivierung von MCs bestätigt und auf die TLR induzierte Aktivierung ausgeweitet. Es wurden auch erste Einblicke in die molekularen Mechanismen, die zum Abbau von SHIP führen, erlangt. Die Ergebnisse dieser Studie leisten somit einen wichtigen Beitrag in der Entwicklung von neuen Tumortherapien, die die zentrale Funktion von SHIP als Ansatzpunkt haben.