Identification of a novel synaptic G protein-coupled receptor controlling nicotine dependence and withdrawal

Abstract

This work identifies a novel synaptic G protein-coupled receptor, Gpr151, present only in habenular neurons in the human and mouse brain, as a novel target for the development of smoking cessation therapies. Therefore it provides new insights into the biology of this specific neuronal cell type and into the functional role of Gpr151. This study was prompted: first, by our discovery of the habenula as a key brain area controlling nicotine consumption and withdrawal (Frahm et al., 2011; Gorlich et al., 2013; Slimak et al., 2014) and second, by the identification of Gpr151 as highly and specifically enriched in cholinergic neurons of the medial habenula using the TRAP methodology when compared to previously collected TRAP data from different cell types in the CNS (Gorlich et al., 2013). Three main conclusions can be drawn from this work: First, I show that Gpr151 is exclusively localized at the axonal projections of habenular neurons where it plays a key role in regulating nicotine dependence and nicotine withdrawal. Gpr151-expressing neurons of the medial and lateral habenula project mainly to the interpeduncular nucleus (IPN), the rostromedial tegmental nucleus (RMTg) and the raphe nuclei. Respectively, the MHb-IPN tract modulates nicotine-related behaviors, the RMTg regulates negative reward and the raphe nuclei are responsible for releasing serotonin to other parts of the brain, suggesting that Gpr151 could modulate the nicotine addiction circuit, reinforcement learning, pain, stress and depression-like behavior among others. I demonstrate that Gpr151 deletion or shRNA-mediated downregulation increased the sensitivity to nicotine-conditioned reward. In addition, deletion of Gpr151 induced an anxiety-like response and an increase in the number of somatic signs in mice undergoing nicotine withdrawal, indicating that Gpr151 expression in habenular terminals attenuates physical and affective signs of nicotine withdrawal. Second, I show by electron microscopy that Gpr151 is localized at habenular presynaptic terminals in the interpeduncular nucleus, specifically at the plasma membrane close to the active zone and also in association with synaptic vesicles. These findings are critically important because they clearly identify Gpr151 as a novel presynaptic component in close proximity to the active zone and specific for habenular synapses. Further, the colocalization with the transporter VGlut1 in synaptic vesicles indicates that Gpr151 might be translocated from the synaptic vesicles to the plasma membrane when habenular neurons are depolarized and glutamate-filled synaptic vesicles are released. These results together with the behavioral analysis, suggest that Gpr151 at the plasma membrane of habenular presynaptic terminals may act as an inhibitory feedback regulator of habenula signaling. Third, analysis of the Gpr151 signaling pathway indicates that Gpr151 couples to the Gαi/o protein. I observed an increase of cAMP levels in the habenular terminals of Gpr151 knockout mice. Remarkably cAMP at the habenular terminals has been shown to modulate neurotransmitter release (Hu et al., 2012). Depletion of presynaptic cAMP levels in medial habenular neurons led to a reduction of protein kinase A activity and consequently to a suppression of glutamate release (Hu et al., 2012). These data together with the behavioral analysis suggest that increased levels of cAMP in the habenular terminals of Gpr151-KO mice facilitate nicotine-induced neurotransmitter release. Activation of the MHb-IPN pathway triggers an inhibitory motivational signal that limits nicotine intake (Fowler et al., 2011; Frahm et al., 2011). Therefore I hypothesize that increased levels of cAMP in the MHb terminals of Gpr151-KO increases the magnitude of this inhibitory signal, leading to increased sensitivity to nicotine-induced reinforcement responses and increased somatic and affective signs of nicotine withdrawal. Altogether these results highlight the importance of Gpr151 for smoking-related diseases. Current therapies for nicotine addiction are hampered by serious side effects since they act on nicotinic and/or dopamine targets in the mesocorticolimbic reward system. In addition the success rate of these therapies is less than 30% (Crooks et al., 2014). Thus alternative and more efficacious pharmacotherapies to target the negative states of withdrawal are required. Human genetics studies have identified several loci associated with heavy smoking and lung cancer in relation to nicotinic acetylcholine receptors. Importantly, although α4β2 and α7 nAChRs are the major subtypes present in the brain, genome wide association studies (GWAS) have not linked these genes to nicotine abuse. Rather, they have established a strong association between SNPs in the CHRNB4-A3-A5 gene cluster and smoking dependence, indicating that α3β4α5 nAChRs, which are mostly restricted to the MHb-IPN pathway in the CNS, are critical for acquisition of nicotine dependence and difficulties in smoking cessation. However because α3β4α5 receptors are also expressed in ganglia in the PNS, antagonists of these cholinergic receptors are expected to have undesired side effects. Therefore an ideal candidate for such therapies is Gpr151 as the habenula-interpeduncular nucleus tract has never been previously targeted. The studies presented here favor the hypothesis that a Gpr151 agonist would be a very valuable therapeutic target not only for smoking cessation, as it could decrease the magnitude of the negative states associated with nicotine withdrawal such as anxiety, but also as a deterrent to become nicotine dependent, since a Gpr151 agonist would decrease the sensitivity to nicotine reward.

In dieser Arbeit wurde der neue G-Protein-gekoppelte Rezeptor Gpr151, der im Menschen- und Mäusehirn nur in Neuronen der Habenula zu finden ist, als neuer potentieller Angriffspunkt für die Rauchentwöhnungstherapie entdeckt. Damit bietet diese Arbeit neue Einblicke in die Biologie und die Funktion dieses spezifischen, neuronalen Zelltyps und von Gpr151. Als Grundlage für diese Arbeit dienen erstens Befunde welcher der Habenula Schlüsselfunktionen im Nikotinkonsum sowie Nikotinentzug zuweisen (Frahm et al., 2011; Görlich et al., 2013; Slimak et al., 2014), und zweitens Befunde aus vergleichenden TRAP- Analysen (Görlich et al., 2013), die Gpr151 als hoch prominent und spezifisch in cholinergen Neuronen der medialen Habenula ausweisen. Drei Hauptaussagen können aus dieser Arbeit getroffen werden: Erstens: Gpr151 ist ausschließlich in axonalen Projektionen der Habenula zu finden und spielt dort eine Schlüsselrolle in der Regulation von Nikotinabhängigkeit und Nikotinentzug. Gpr151 exprimierende Neurone der medialen und lateralen Habenula projizieren hauptsächlich zum interpeduncular nucleus (IPN), dem rostromedialen tegmental nucleus (RMTg) und den raphe Kernen. Verhalten, das mit Nikotinkosum in Bezug gesetzt wird, ist durch den MHb-IPN Signalweg, Vermeidungsverhalten durch den RMTg, und Serotonin-Ausschüttung von den raphe Kernen moduliert. Dies lässt vermuten, dass Gpr151 unter anderem Nikotinabhängigkeit, bestärkendes Lernen, Schmerz, Stress und depressives Verhalten beeinflusst. In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass eine Gpr151 Gendeletion oder eine shRNA-vermittelte Expressionsreduktion, die Sensitivität von Nikotin-konditioniertem Belohnungsverhalten erhöht. Zudem induziert die Gendeletion von Gpr151 in Mäusen ein Angst-ähnliches Verhalten sowie eine erhöhte Zahl an somatischen Symptomen im Nikotinentzug woraus zu schließen ist, dass die Gpr151 Expression in Terminalen der Habenula physische und somatische Entzugserscheinungen vermindert. Zweitens: Mit elektronenmikroskopischen Aufnahmen konnte ich zeigen, dass Gpr151 im IPN in Axonterminalen der Habenula vor allem an der Plasmamembran der aktiven Zone sowie vereinzelt an synaptische Vesikel assoziiert ist. Da diese Ergebnisse Gpr151 klar als neue präsynaptische Komponente in der aktiven Zone der habenula Terminalen zeigt, sind sie von besonderer Bedeutung, Da meine Ergebnisse zudem eine Kolokalisation von Gpr151 mit dem vesikulärem Glutamat Transporter VGlut1 in synaptischen Vesikeln zeigt, vermute ich, dass Gpr151 durch Depolarisation von Habenulaneuronen und folgender Glutamatausschüttung in die Plasmamembran eingebracht wird. Dies lässt zusammen mit meinen Verhaltensexperimenten vermuten, dass Gpr151 an der präsynaptischen Membran die Habenula-IPN Signalübertragung reguliert. Drittens: Meine Analysen deuten darauf hin, das Gpr151 mit dem Gαi Protein gekoppelt ist. In habenula Terminalen von Gpr151 knockout (KO) Mäusen konnte ich eine Erhöhung des cAMP Levels erkennen. Ein verringerter cAMP Spiegel in präsynaptischen Terminalen der medialen Habenula führt zu einer Reduktion der Proteinkinase A Aktivität und folglich zu einer verminderten Glutamatausschüttung (Hu et al., 2012). Zusammen mit meinen Verhaltensexperimenten deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass ein erhöhter cAMP Level in habenula Terminalen von Gpr151-KO Tieren die nikotin-induzierte Neurotransmitterfreisetzung erhöht. Durch Aktivierung des MHb-IPN Trakts wird die Nikotin-Einnahme auf Grund Demotivation reduziert (Fowler et al., 2011; Frahm et al., 2011). Ich vermute daher, dass der erhöhte cAMP Level in MHb Terminalen von Gpr151-KO Mäusen inhibitorische Signale potenziert, somit die Reaktion auf Nikotin verstärkt und zu erhöhten somatischen und affektiven Signalen des Nikotinentzugs führt. Zusammengefasst unterstreichen meine Ergebnisse die wichtige Bedeutung von Gpr151 für durch Rauchen verursachte Krankheiten. Da derzeitige Therapien zur Rauchentwöhnung an nikotinergen und/oder dopaminergen Rezeptoren im mesocorticolimbischen System agieren, bedingen sie schwerwiegende Nebenwirkungen und sind daher unbefriedigend. Hinzu kommt, dass weniger als 30% der derzeitigen Therapien erfolgreich sind (Crooks et al., 2014). Alternative, effektivere pharmakologische Therapien mit reduzierten Nebenwirkungen sind notwendig. Humane Genanalysen haben starkes Rauchen und das Risiko an Lungenkrebs zu erkranken mit nikotinergen Acetylcholin Rezeptoren (nAChR) in Verbindung gebracht. Obwohl α4β2 und α7 nAChRs die Haupt-Rezeptoruntereinheiten des CNS sind, konnten sie in genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) nicht mit Nikotinmissbrauch in Verbindung gesetzt werden. Nikotinabhängigkeit wurde vielmehr mit SNPs im CHRNB4-A3-A5 Gen-Cluster und damit mit α3β4α5 nAChRs welche vor allem im MHb- IPN Trakt im CNS vorkommen, assoziiert. Da α3β4α5 nAChRs auch in Ganglien des PNS exprimiert sind, ist zu vermuten, dass Antagonisten gegen diesen Rezeptor unerwünschte Nebeneffekte mit sich bringen. Die hier dargelegten Ergebnisse favorisieren die Hypothese, dass ein Gpr151 Agonist eine sehr nützliche Alternative zu derzeitig praktizierten Rauchentwöhnungstherapien seien kann. Da Gpr151 zudem die belohnenden Effekte von Nikotin verringert, ist ein Agonist auch als Präventionsmittel zur Nikotinabhängigkeit denkbar.