Charakterisierung von Mg²+-Effluxmechanismen bei kultivierten ruminalen Epithelzellen

Abstract

Beim Wiederkäuer wird Magnesium hauptsächlich aus dem Vormagen, speziell dem Pansen resorbiert. Der gerichtete Transport über das Pansenepithel erfolgt transzellulär und setzt daher voraus, dass spezifische Transportproteine die Aufnahme bzw. Abgabe von Mg²+ über die apikale bzw. basolaterale Membran der ruminalen Epithelzellen vermitteln. Funktionelle in vitro-Studien an verschiedenen Geweben und Zellsystemen zeigten, dass der Mg²+-Efflux hauptsächlich über einen Na+/Mg²+-Austauscher erfolgt. Dieses Transportsystem dient der Aufrechterhaltung der physiologischen intrazellulären freien Mg²+-Konzentration (Mg²+]i), welche für eine Vielzahl biologischer Prozesse von Bedeutung ist. Darüber hinaus soll der Austauscher bei Epithelien die Abgabe von Mg²+ über die basolaterale Membran vermitteln. Untersuchungen an isolierten Epithelien des Schafpansens und an kultivierten ruminalen Epithelzellen gaben Hinweise auf die Existenz eines Na+-abhängigen Mg²+-Transportes am Pansenepithel. Das Ziel der vorliegenden Untersuchungen war es daher, den Na+/Mg²+-Austauscher als Mg²+-Effluxmechanismus auf zellulärer Ebene zu charakterisieren. Zu diesem Zweck wurde mittels fluoreszenzspektrometrischer Methoden die Mg²+-Abgabe aus kultivierten ruminalen Epithelzellen unter verschiedenen Bedingungen geprüft. Insbesondere wurden der Einfluss der extrazellulären [Na+], die Wirkung von Inhibitoren sowie mögliche Regulationsmechanismen untersucht. Die experimentellen Arbeiten führten zu folgenden Ergebnissen: Die Abgabe von Mg²+ aus Pansenepithelzellen (PEZ) wird überwiegend durch einen Na+/Mg²+-Austauscher vermittelt. Unter den gewählten experimentellen Bedingungen lag der Anteil des Na+-abhängigen Mg²+-Efflux bei 97 Prozent. Die Transportkapazität des Austauschers war abhängig von der extrazellulären Na+-Konzentration ([Na+]e). Sie stieg von 18.3±9.5 µmol∙l-1 Zellen∙min-1 im Na+-freien Medium auf 0.62±0.31 mmol∙l-1 Zellen∙min-1 im Medium mit physiologischer [Na+] und zeigte eine typische Sättigungskinetik. Mit Bezug auf die [Na+]e wurden ein KM-Wert von 24 mmol/l und eine maximale Transportkapazität (Vmax) von 11 mmol∙l-1 Zellen∙15 min-1 ermittelt. Imipramin, ein Hemmstoff, von dem bekannt ist, dass er den Na+/Mg²+-Austauscher inhibiert, reduzierte die Mg²+-Abgabe aus PEZ um 48%. Die Aktivität des Na+/Mg²+-Austauschers wird durch die intrazelluläre cAMP- Konzentration ([cAMP]i) moduliert. Eine Erhöhung der [cAMP]i steigert den Mg²+-Efflux um 55% gegenüber den Ausgangswerten. Ein Effekt von cAMP auf andere Mg²+-Transportsysteme konnte ausgeschlossen werden. Eine Stimulation des Mg²+-Efflux wurde auch nach Applikation von Prostaglandin E2 (PGE2) nachgewiesen. Neben dem Na+/Mg²+-Austauscher kann eine Mg²+-Abgabe über einen Cobalt(III)hexamin-sensitiven Mechanismus (Mg²+-Kanal) erfolgen. Dieser Vorgang war in Einzelfällen, insbesondere bei Zellen in einem fortgeschrittenen Differenzierungsstadium, zu beobachten. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass in der Zellmembran kultivierter PEZ ein Na+/Mg²+-Austauscher existiert. Das Transportprotein vermittelt bei physiologischen intra- und extrazellulären [Na+] den Hauptteil des Mg²+-Effluxes. Die Regulation der Mg²+-Abgabe erfolgt dabei über cAMP- abhängige Signaltransduktionswege. Der Austauscher ist von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der [Mg²+]i im Rahmen der zellulären Mg²+-Homöodynamik. Es kann davon ausgegangen werden, dass dem ruminalen Na+/Mg²+-Austauscher eine wesentliche Rolle im Prozess der Mg²+-Resorption zukommt.

The rumen is the major side of Mg²+ absorption in ruminants. The unidirectional transport across the ruminal epithelium is mediated by a transcellular pathway, indicating the existence of specific transport proteins for the uptake and release of Mg²+ across the apical and basolateral side of ruminal epithelial cells. A Na+/Mg²+ exchanger was identified as the predominant Mg²+ efflux mechanism in functional in vitro studies of various tissues and cell systems. This transport system was observed to maintain the physiological free intracellular concentration of Mg²+ ([Mg²+]i) by Mg²+ extrusion on the basolateral side in epithelial tissues. Evidence of a Na+ dependent Mg²+ transport mechanism in the ruminal epithelium of sheep was found in prior studies on isolated ruminal epithelium and cultured ruminal epithelial cells. The aim of the present study was to confirm the previous findings and to characterize the Na+/Mg²+ exchanger by fluorescence spectrometric analysis of the cellular Mg²+ efflux under different conditions. Influences of the extracellular concentration of Na+ ([Na+]e), effects of inhibitors on Mg²+ efflux and regulation mechanism were primarily investigated. The following results were achieved: Extrusion of Mg²+ from ruminal epithelial cells (REC) is predominantly mediated by the Na+/Mg²+ exchanger with a share of 97 percent of total Mg²+ efflux under selected experimental conditions. The transport capacity was increased depending on [Na+]e from 18.3±9.5 µmol∙l-1 cells∙min-1 in a Na+-free medium to 0.62±0.31 mmol∙l-1 cells∙min-1 in a medium with a physiological [Na+]e according to a typical saturation kinetic. A KM for extracellular Na+ of 24 mmol/l and a maximal transport capacity (Vmax) of 11 mmol∙l-1 cells∙15 min-1 was calculated. Imipramine, known as an inhibitor of the Na+/Mg²+ exchanger, decreased the Mg²+ efflux by 48%. The activity of the Na+/Mg²+ exchanger was modulated by intracellular cAMP concentration ([cAMP]i). Rise of [cAMP]i increased the Mg2+ efflux by 55% compared to the initial values. Other Mg²+ transport systems were not affected by cAMP. Mg²+ efflux was also stimulated after application of prostaglandine E2 (PGE2). Finally, a cobalt(III)hexamine sensitive mechanism (Mg²+ channel) was observed in several cases, especially in cells at a late stage of differentiation. It is assumed to mediate Mg²+ efflux in addition to the Na+/Mg²+ exchanger. These results clearly demonstrate the existence of a Na+/Mg²+ exchanger in the cell membrane of cultured REC. With a physiological intracellular and extracellular [Na+], Mg²+ efflux is mainly mediated by this transport protein under the control of a cAMP-dependent signaling pathway. Therefore, the exchanger is of great importance for the maintenance of the free [Mg2+]i within cellular Mg²+ homeodynamics. The ruminal Na+/Mg²+ exchanger can be assumed to play a considerable role in the process of Mg²+ resorption.