Entwicklung und Charakterisierung verschiedener neuartiger bispezifischer Antikörper basierend auf PankoMab-GEX™ zur Verbesserung der Tumortherapie

Abstract

T-Zellen besitzen zahlreiche wertvolle Eigenschaften für die Tumortherapie. Mit bis zu 80% bilden die verschiedenen T-Zell Subpopulationen den Hauptteil der Lymphozyten im peripheren Blut und zeichnen sich zusätzlich durch eine starke Proliferation in Folge einer Aktivierung und einer hohen Zytotoxizität aus. Eine Möglichkeit T-Zellen für die Tumortherapie gezielt zu nutzen, stellen T-Zell-rekrutierende bispezifische Antikörper dar, wobei die therapeutische Anwendung häufig von hohen Nebenwirkungen aufgrund von Zytokinsekretion der T-Zellen, aber auch aufgrund der unzureichenden Selektivität der Expression des Zielantigens begleitet wird. So zeichnen sich die meisten der aktuell verwendeten Tumorantigene nur durch eine erhöhte Expression auf Tumorzellen aus, werden aber auch auf zahlreichen Normal- geweben exprimiert. Um die Anwendbarkeit von T-Zell-rekrutierenden Antikörpern weiter zu verbessern, sind daher Tumorantigene von höchstem Interesse, die keine Expression auf Normalgeweben zeigen. Ein solches Antigen ist TA-MUC1, das nur auf Tumorzellen für Antikörper zugänglich ist. Das Ziel der Arbeit bestand in der Produktion und Charakterisierung von verschiedenen, gegen TA- MUC1 gerichteten, T-Zell-rekrutierenden Antikörpern, um zu untersuchen, ob TA- MUC1 ein geeignetes Antigen für die Rekrutierung von T-Zellen darstellt. Als Grundlage für die bispezifischen Antikörper wurden zunächst verschiedene gegen CD3 gerichtete monoklonale Antikörper hinsichtlich ihrer T-Zell-Bindung und -Aktivierung untersucht und die vielversprechendsten Kandidaten für die Expression als bispezifische Antikörper ausgewählt. Dabei konnten auch die bispezifischen Antikörper mit hohen Produktivitäten in GlycoExpress® herstellt und durch die Etablierung geeigneter Aufreinigungsschritte erfolgreich isoliert werden. Funktionell wurden zunächst drei Konstrukte verglichen, bei denen verschiedene anti-CD3 scFv an die Cκ-Domäne eines IgG1 fusioniert wurden. Trotz vergleichbarer Bindung zeigten die scFv-Domänen Unterschiede in der vermittelten T-Zell-Aktivierung und induzierten Zytokinfreisetzung in unterschiedlichem Maße, wobei scFvOkt3.2 sich durch eine verringerte Tumorzell-unabhängige Zytokinfreisetzung und T-Zell-Aktivierung auszeichnete. Um einen Einfluss des gewählten Formates zu untersuchen, wurden anschließend zwei Konstrukte detaillierter funktionell analysiert, bei denen scFvOkt3.2 an die Cκ- oder an die CH3-Domäne fusioniert wurde. Dabei führte die Fusion an die CH3-Domäne zu den besten funktionellen Ergebnissen. So vermittelte dieses Konstrukt eine im Vergleich verbesserte CD3-Bindung, was zu einer starken Aktivierung und Proliferation von T-Zellen sowie zu einer starken zytotoxischen Wirkung gegen TA-MUC1-positive Tumorzellen führte. Überraschend war jedoch das Ergebnis, dass trotz der verbesserten CD3-Bindung eine verbesserte Tumorzell-unabhängige Aktivierung und Costimulation durch das Cκ- Konstrukt vermittelt wurde. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit die Eignung von TA-MUC1 als vielversprechendes Tumorantigen für T-Zell- rekrutierenden Antikörper gezeigt werden. Die untersuchten PM-CD3-Konstrukte vermittelten in vitro alle wichtigen Funktions-weisen, wie Aktivierung und Proliferation von T-Zellen sowie Zytotoxizität. Für eine klinische Anwendung sind allerdings noch weiterführende sicherheitsrelevante Untersuchungen nötig.

T cells possess several valuable properties for tumor therapy. With up to 80% different T cell subsets account for the majority of the lymphocyte population within the peripheral blood, which proliferate strongly and are highly cytotoxic after activation. One opportunity to use T cells for tumor therapy is the development of T cell recruiting bi-specific antibodies. However, the therapeutic application of those antibodies is often accompanied by severe adverse events that mainly depend on cytokine release by T cells as well as the non-selective expression of targeted tumor antigen. Most tumor antigens in clinical use are characterized by upregulated expression on tumor cells but show broad expression on normal healthy tissue as well. To reduce effects on healthy cells antigens that are exclusively expressed on tumor cells are of highest interest. One such promising tumor antigen is TA-MUC1. During this study different T cell recruiting bi-specific antibodies that target TA-MUC1 were produced and characterized to analyze if TA-MUC1 is a suitable antigen for T cell recruitment. Four different anti-CD3 antibodies were analyzed regarding T cell binding and activation to choose the most promising candidates for expression as bi-specific antibodies. As a first step three constructs with three different anti-CD3 scFv’s fused to the Cκ domain of an IgG1 were compared in functional assays. Despite comparable CD3 binding the scFv’s showed clear differences in T cell activation and cytokine release. The antibody construct containing scFvOkt3.2 induced less target cell independent cytokine release and T cell activation compared to the other constructs. Following the analysis of the different scFv’s two constructs, scFvOkt3.2 fused to the Cκ or CH3 domain, were characterized in more detail to analyze a potential influence of the chosen construct format. The subsequent functional tests showed best results for the CH3 fusion. This construct mediated improved CD3 binding leading to enhanced T cell activation and proliferation as well as to increased cytotoxicity against TA-MUC1 positive tumor cells. Surprisingly stronger target cell independent activation and costimulation was mediated by the Cκ construct. In summary this study shows that TA-MUC1 is a valuable tumor antigen for T cell recruiting bi-specific antibodies. The analyzed PM-CD3 constructs are able to induce in vitro T cell activation and proliferation as well as T cell dependent cytotoxicity. However, for clinical application additional assays regarding the safety profile are necessary.