Regulation von Ras-Zielgenen durch DNA-Methylierung und Histon-modifizierende Mechanismen

Abstract

In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Methylierung und Acetylierung auf die Expression von insgesamt acht Ras-abhängig regulierten Genen in den Rattenfibroblasten 208F (immortal) und FE-8 (Hras-Onkogen transformiert) untersucht. Alle Gene sind Zielgene des Raf/MEK/ERK-Signalwegs in den FE-8 Zellen und werden durch einen aktivierten Signalweg supprimiert. Durch pharmakologische Hemmung des Signalwegs werden diese Gene aufreguliert. Clusterin, Loxl2, Mmp2, Thbs1, Timp2 und Lgals3bp wurden zusätzlich durch das demethylierende Agens 5-Aza-CdR in den Ras-transformierten FE-8 Zellen aufreguliert. Anders als in den Vorversuchen wies Fstl1 keine Regulierung und Lox sogar eine weitere Suppression unter 5-Aza-CdR auf. Inhibition der Histondeacetylasen durch TSA führte zu einer Aufregulierung von Clusterin, Loxl2, Mmp2, Thbs1 und Timp2. Lox und Lgals3bp zeigten eine Suppression unter TSA, Fstl1 keine Expressionsänderung. siRNA gegen DNMT1 hatte eine Reexpression von Clusterin und Mmp2 in den FE-8 Zellen zur Folge, die übrigen Gene wurden nicht analysiert. Diese Experimente lassen epigenetische Mechanismen in der Inaktivierung dieser Gene nach Ras-Transformation vermuten. Für das Gen Clusterin konnte tatsächlich eine methylierungsabhängige Regulation nachgewiesen werden [Lund et al., 2006]. Die Gene Loxl2, Mmp2, Timp2, Thbs1 und Lgals3bp werden zumindest indirekt reguliert. Für Timp2 und Lgals3bp kann ein räumlicher Effekt auf der DNA mit übergeordneten regulatorischen Elementen für eine epigenetische Regulation postuliert werden: beide Gene liegen auf dem Chromosom 10q32.3, zwischen ihren Transkriptionsstartpunkten befinden sich keine weiteren kodierenden Regionen. Der Mechanismus der Ras-abhängigen Methylierung ist unklar, jedoch stellt DNMT1 ein mögliches Schlüsselenzym dar. Für einige der untersuchten Gene ist bereits eine Beteiligung an der Transformation oder der Tumorgenese bekannt. Weitere Grundlagenforschung ist notwendig, um die komplexen Mechanismen der Genregulation (in Tumorzellen) aufzudecken.

Within the current thesis, the influence of DNA methylation and histone deacetylation onto the expression of eight Ras-dependent regulated genes was investigated in immortalized (208F) and Hras-transformed (FE-8) rat fibroblasts. All genes are target genes of the Raf/MEK/ERK-signal transduction pathway in FE-8 cells and are suppressed through an activated pathway. Upon pharmacological inhibition of the pathway, the genes get re-expressed. Clusterin, Loxl2, Mmp2, Thbs1, Timp2 and Lgals3bp also became upregulated in the Hras-transformed cells upon treatment with the demethylating agent 5-Aza- CdR. In contrast to preliminary investigations, Fstl1 was not upregulated and Lox was even further suppressed by 5-Aza-CdR. Inhibition of Histon deacetylases by Trichostatin A resulted in an upregulation of Clusterin, Loxl2, Mmp2, Thbs1 and Timp2. The expression of Lox and Lgals3bp was suppressed; the expression of Fstl1 was not influenced. siRNA against DNMT1 in the Hras-transformed cells resulted in a re-expression of Clusterin and Mmp2, the other genes were not analysed. These experiments suggest an involvement of epigenetic mechanisms in the suppression of genes following Ras transformation. For the Clusterin gene, a methylation-dependent regulation could indeed be proven [Lund et al., 2006], while Loxl2, Mmp2, Thbs1 and Timp2 are likely to be regulated indirectly via DNA methylation. A territorial effect on DNA with higher-ranking regulatory elements mediating an epigenetic regulation was postulated for Timp2 and Lgals3bp: both genes are located on chromosome 10q32.3 with no other coding regions in between. The mechanism of RAS-dependent epigenetic regulation is unclear, however DNMT1 must be discussed as one of the key enzymes. An involvement in transformation or tumour genesis is already known for most of the genes investigated. Further research is necessary to reveal the complex mechanisms of gene regulation (in tumour cells).