Hypothermie-induzierte zelluläre und molekulare Mechanismen in ischämisch geschädigten Zellen

Abstract

Hypoxisch-ischämische Ereignisse, die beispielsweise durch Herzkreislaufstillstand oder Schlaganfall verursacht werden, führen zu schwerer Zellschädigung. Das Absenken der Körpertemperatur stellt dabei eine effektive Methode zum Schutz vor Ischämie- und Reperfusionsschädigung im Gehirn und Herzen dar. Die genauen protektiven Mechanismen sind jedoch noch nicht vollständig verstanden. Intrazerebral kann Hypothermie einen Ischämie-induzierten Zelltod reduzieren und die dadurch hervorgerufene Neuroinflammation beeinflussen. Ähnliche neuroprotektive Eigenschaften werden durch die Applikation des Immunsuppressors Cyclosporin A (CsA) diskutiert. In der ersten Studie wurde der Einfluss der Hypothermie, der Behandlung mit CsA sowie die Kombination beider Interventionen nach einstündiger Sauerstoff-Glukose-Deprivation, gefolgt von 24-stündiger Reperfusion (OGD/R) in murinen BV 2 Mikroglia, primären Neuronen und organotypischen hippocampalen Schnittkulturen (OHSC) untersucht. Die postischämische Kühlung auf 33,5 °C reduzierte den Zelluntergang von OGD-geschädigten OHSC und konnte die Aktivierung der BV 2 Mikroglia mindern. Die Behandlung mit 10 µM CsA reduzierte die Expression von IL 1β und Iba1 in BV 2 Mikroglia, hatte jedoch einen toxischen Effekt auf OGD-geschädigte primäre Neurone und OHSC. Eine Kombination beider Interventionen hatte keinen zusätzlichen Effekt auf BV 2 Mikroglia und primäre Neurone, führte allerdings in OGD/R-geschädigten OHSC zu einer gesteigerten Inflammation gemessen durch die Induktion der TNF α, MCP1, IL 6 und Iba1 Genexpression. Angelehnt an das Protokoll für Kühlung nach perinataler Asphyxie wurde in der zweiten Studie der Effekt einer bis zu 72-stündigen Kühlung nach einer 24-stündigen, schweren (0,2 % O2) oder moderaten (8 % O2) Hypoxie untersucht. Schwere Hypoxie führte zum Zelluntergang in der humanen neuronalen Zelllinie SK N SH, welcher durch die Kühlung auf 33,5 °C reduziert wurde. Gleichzeitig wurde die Expression des Kälteschockprotein RBM3 unter Kühlung erhöht. Somit stellt die RBM3-Expression einen möglichen, durch Hypothermie vermittelten Schutz bei Hypoxie-geschädigten neuronalen Zellen dar. In der dritten Studie wurde am Modell eines Myokardinfarkts der Effekt einer intraischämischen Kühlung in OGD/R-geschädigten murinen HL-1 Kardiomyozyten untersucht. Die Zellen wurden innerhalb der sechsstündigen OGD-Phase und in der Reperfusion für insgesamt 24 Stunden auf 33,5 °C gekühlt. Hypothermie erhielt die Integrität der mitochondrialen Membran und verhinderte dabei die Ausschüttung von AIF und Cyto C, induzierte das antiapoptotische Hsp70, erhöhte das Bcl 2/Bax Verhältnis und die LC3-II Expression. Der Einsatz früher Hypothermie führte somit zum Schutz der Herzmuskelzellen vor intrinsischer Apoptose und aktivierte zudem protektive Autophagiemechanismen. Zusammenfassend wurden durch die Studien weitere zugrunde liegende, protektive Mechanismen der Hypothermie bei Ischämie- und Reperfusionsschädigung aufzeigt. Zudem wurde in der Arbeit erstmalig beschrieben, dass die Kombinationstherapie aus Hypothermie und CsA Behandlung in komplexen Gewebekulturen nicht neuroprotektiv wirkt, sondern eine Neuroinflammation induziert.

Hypoxic-ischemic events occur as a result of cardiac arrest or stoke can lead to severe cell damage. Cell death in the brain and heart after ischemia and reperfusion damage is most effectively reduced by hypothermia, but the underlying protective mechanisms are not yet fully understood. However, the neuroinflammatory response induced by ischemic cell death is a major secondary injury mechanism that has been shown to be attenuated by hypothermia. Similar neuroprotective properties of the immunosuppressor cyclosporin A (CsA) are also discussed. In the first study, we investigated the effects of hypothermia, treatment with CsA, and a combined treatment of both interventions on oxygen-glucose deprived and reperfused (OGD/R) murine BV-2 microglia, primary neurons, and organotypic hippocampal slice cultures (OHSC). Post-ischemic cooling to 33.5 °C decreased OGD-induced cell death in OHSC, and reduced activation of BV-2 microglia. Treatment with 10 μM CsA reduced expression of IL-1β and Iba1 in BV-2 microglia, but was toxic in OGD–damaged neurons and OHSC. Combined treatment of post-ischemic cooling and CsA during OGD/R had no further effect on BV-2 microglia and primary neurons, but increased inflammation in OHSC by induced expression of TNF-α, MCP1, IL-6, and Iba1. According to clinical cooling guidelines after perinatal asphyxia, in the second study we investigated the neuroprotective effects of 72 hours long hypothermia and RBM3 expression by mild (8 % O2) and severe (0.2 % O2) hypoxia-induced injury in human SK-N-SH neuronal cells. Severe hypoxia followed by reoxygenation lead to cell death, which was reduced by cooling. Simultaneously, protein expression of RBM3 was upregulated by cooling. As a result, hypothermia induced RBM3 expression might be an important factor in rescuing hypoxic damaged neuronal cells. In the third study, we investigated the effects of intra-ischemic cooling on OGD/R damaged murine HL-1 cardiomyocytes as a model of cardiac arrest. Hypothermic treatment preserved mitochondrial membrane integrity and reduced releases of AIF and cytochrom C. Simultaneously, anti-apoptotic Hsp70, Bcl2/Bax-ratio, and autophagic LC3-II expressions were induced by cooling. Early application of hypothermia thereby protects the cardiomyocytes by inhibiting intrinsic apoptosis and activating protective autophagy mechanisms. In summary, we showed hypothermia-mediated mechanisms to protect cells from ischemia and reperfusion induced damage. Additionally, we described for the first time that combined hypothermia and CsA treatment in the complex slice cultures is not neuroprotective, but induces neuroinflammation that could result in increased neurotoxicity.