Komplementregulation in Sehnenzellen, vermittelt durch das Anaphylatoxin C5a und Leukozyten

Abstract

Einleitung: Bei Entzündungen des Sehnengewebes kommt es zu einem Zusammenspiel von pro- und anti-inflammatorischen Zytokinen und dem Komplementsystem (CS) sowie einer erhöhten Präsenz von Leukozyten. Während das Spaltprodukt des Komplementproteins C5, C5b durch MAC-Bildung zur osmotischen Lyse einer Zelle führt, bindet C5a am C5aR um seine inflammatorische Wirkung zu entfalten. Die Komplement-regulatorischen Proteine (CRPs) verhindern im Gegensatz dazu die spontane Aktivierung des CS. Leukozyten könnten in einer Tendinopathie Signale vermitteln, die eine Komplementregulation beeinflussen könnten. Ziel: Das Ziel dieser in vitro Studie ist die Wechselwirkung des Anaphylatoxins C5a und von Leukozyten mit Tendozyten sowohl in Bezug auf die Genexpression (GE) als auch die Proteinsynthese des C5aRs und der CRPs (CD46, CD55 und CD59) zu verstehen. Methodik: Kultivierte primäre humane Hamstring-Sehnenzellen wurden für 30 min, 4 h und 24 h mit rekombinantem C5a in zwei verschiedenen Konzentrationen (25 ng/mL und 100 ng/mL) stimuliert. Zusätzlich wurden Tendozyten mit humanen Leukozyten (Peripheral Blood Mononuclear Cells [PBMCs] und neutrophilen Granulozyten [Neutros]) 1:40 in einem indirekten Ko-Kultursystem (+/-10 ng/mL TNFα) für 4 h und 24 h kultiviert. Die GE von C5aR, CD46, CD55 und CD59 wurde mit Hilfe der RTD-PCR analysiert. Das Überleben der Tendozyten- und Leukozyten wurde nach 24 h durch eine Lebend-Tod Färbung analysiert. Darüber hinaus wurden die Proteine C5aR und CD55 in den Tendozyten durch eine Immunfluoreszenzmarkierung untersucht. Ergebnisse: Die 30 minütige C5a- Stimulation (25 ng/mL) führte in Tendozyten zu einer Induktion der GE von CD55 und CD59, wobei gleichzeitig eine signifikante Reduktion der GE von C5aR, CD46 und CD59 nach 24 h Stimulation nachgewiesen werden konnte. Im Ko-Kulturversuch bewirkte TNFα nach 4 h eine signifikante Induktion der C5aR Genaktivität. Nach 24 h konnte bei Präsenz der PMBCs (+TNFα) eine signifikante Hemmung der C5aR GE beobachtet werden. Die GE des zytoprotektiven CD59 wurde durch TNFα, PBMCs (+/-TNFα) und Neutros (-TNFα) supprimiert und die Expression des CD46 durch Neutros (-TNFα). Auch eine Stimulation der Tendozyten for 24 h mit Neutros (+/-TNFα) führte zu einer Suppression der CD55 GE, die Stimulation mit PBMCs (-TNFα) supprimierte die CD46 Genaktivität. Die Immunfärbung der Proteine C5aR und CD55 bestätigte weitgehend die GE. Keine der Stimulationen führte zu Vitalitätseinschränkungen der Tendozyten nach 24 h. Schlussfolgerung: Es konnte nachgewiesen werden, dass Zeit- und Konzentrations-abhängige Effekte der C5a und Leukozyten auf die Komplementregulation in den Tendozyten ausgelöst werden. Die Komplementaktivität könnte sowohl bei der Entstehung als auch im Heilungsprozess der Sehnenruptur im Rahmen einer Tendinopathie eine Rolle spielen.

Introduction: Inflammatory events in tendon tissues lead to an interplay of pro-/anti-inflammatory cytokines and the complement system (CS). The split fragment of complement protein C5, C5a unfolds its inflammatory effects by binding to C5aR. On the contrary, the complement regulatory proteins (CRP) prevent the ubiquitous complement activation. The leukocytes could also influence the regulation of the complement system in case of a tendinopathy. Objective: The main objective of the present in vitro study was to learn more about the effects of anaphylatoxin C5a and leukocytes on tenocytes in respect to gene regulation of C5aR and CRP (CD46, CD55 and CD59). Methods: Primary human tenocytes derived from Hamstring tendons were cultured in monolayer before directly stimulated with recombinant C5a in concentrations (25 ng/mL, 100 ng/mL) for 30 min, 4 h and 24 h. Additionally, tenocytes and human leukocytes (Peripheral Blood Mononuclear Cells [PBMCs] and neutrophil granulocytes [Neutros]) were combined 1:40 in an indirect co-culture system (+/-10 ng/mL TNFα) for 4 h and 24 h. The gene expression of C5aR, CD46, CD55 and CD59 was monitored using RTD-PCR. Tenocyte vitality after 24 h stimulation was assessed in both cases by live-dead assay. Immunofluorescence labelling of the proteins C5aR and CD55 on tenocytes was also performed. Results: Tenocytes stimulated with C5a (25 ng/mL) for 30 min showed an induction of the CD55 and CD59 gene expression (GE), whereas a significant decrease of C5aR, CD46 and CD59 mRNA was observed after 24 h stimulation. In the co-culture, tenocytes stimulated with TNFα for 4 h revealed a significant induction of C5aR GE. After 4 h CD59 GE was suppressed by TNFα, PBMCs (+/-TNFα) and Neutros (-TNFα) and that of CD46 by Neutros (-TNFα). Stimulation of tenocytes for 24 h with Neutros (+/-TNFα) led to a significant suppression of CD55 GE and stimulation with PBMCs (-TNFα) suppressed CD46 GE. Live-dead staining showed in both cases no relevant impairment of the vitality of the tenocytes after 24 h. Conclusion: There are time and concentration dependent response in the regulation of complement system in tenocytes to C5a and leukocytes. A misbalance in complement activity could possibly be involved in genesis of tendinopathy as well as in healing process after a tendon rupture in basis of tendinopathy.