Virus-ähnliche Partikel auf Basis des Hamster-Polyomavirus als potentielle Träger für den Gentransfer

Abstract

Erbkrankheiten stellen eine große Herausforderung für die Humanmedizin dar. Das Ziel der somatischen Gentherapie besteht in der Reparatur eines defekten oder falsch regulierten Gens durch Insertion einer intakten Gensequenz. Neben der Anwendung gentherapeutischer Verfahren für die Therapie von monogen bedingten genetischen Erkrankungen wird die somatische Gentherapie auch zur Therapie von Krebserkrankungen und chronischen Virusinfektionen eingeführt. Zur Übertragung des Transgens sind unterschiedliche in vivo-, ex vivo- und in vitro-Verfahren entwickelt worden, die unterschiedliche Vor- und Nachteile hinsichtlich Verpackungskapazität, Immunität, Applikationsweise und Sicherheit bieten. Eine vielversprechende Möglichkeit der Gentherapie stellt die Verwendung von Virus-ähnlichen Partikeln (virus like particles, VLP) dar. Ein möglicher Ausgangspunkt für die Entwicklung von VLP für eine gentherapeutische Anwendung ist das Hauptkapsidprotein VP1 des Hamsterpolyomavirus (HaPyV), das nach heterologer Expression in der Hefe Saccharomyces cerevisiae zu VLP assembliert. Eine Zielstellung dieser Arbeit war die Etablierung von Methoden zur Enkapsidierung von Fremdplasmid-DNA in HaPyV-abgeleiteten VLP und zum Nachweis der erfolgreichen Verpackung der DNA. Hierfür wurde ein bereits etabliertes System zur Synthese und Reinigung von Hefe-exprimierten HaPyV- VP1-VLP verwendet, die das virale Kapsidprotein VP1 enthalten. Die hier entwickelte Methode zum Verpacken von Fremdplasmid-DNA besteht in der Dissoziation der VLP, dem Hinzufügen der Plasmid-DNA und der Reassoziation der VLP. Für den Nachweis der VLP-Reassemblierung und der damit verbundenen Verpackung der Plasmid-DNA wurden verschiedene Verfahren untersucht. Mit Hilfe der Agarosegel-Elektrophorese kann die Assoziation der VLP mit Nukleinsäure leicht nachgewiesen werden. Eine zusätzliche DNase-Behandlung und anschließende Agarose-Gelelektrophorese-Analyse bestätigte den Schutz des verpackten Plasmids gegenüber der DNase-Wirkung, so dass von einer Enkapsidierung des Plasmids in reassemblierte VLP ausgegangen werden kann. Der Nachweis einer Reassemblierung von VLP konnte durch elektronenmikroskopische Verfahren erbracht werden. Im Gegensatz dazu ist ein Hämagglutionationstest nicht für die Unterscheidung von dissoziierten und reassemblierten VLP geeignet. Ein zweiter Schwerpunkt der Arbeit lag in der immunologische Charakterisierung der VLP verschiedener Polyomaviren, um mögliche negative Effekte einer präexistierenden Polyomavirus-spezifischen Immunität abschätzen zu können. Von entscheidender Bedeutung für einen Einsatz von HaPyV- abgeleiteten VLP zur humanen Gentherapie ist die mögliche Kreuzreaktivität von VP1 des HaPyV und humaner Polyomaviren insbesondere wegen der hohen Durchseuchungsrate der Bevölkerung mit humanpathogenen Polyomaviren (BK- Polyomavirus 90% und JC-Polyomavirus 70%). Wegen der großen Sequenzähnlichkeit der VP1-Proteine der verschiedenen Polyomaviren muß von einer starken Kreuzreaktivität ausgegangen werden. Bei allen untersuchten, spontan HaPyV- infizierten Syrischen Hamstern wurde die Bildung von VP1-spezifischen Antikörpern nachgewiesen. Daneben wurden bei fast allen infizierten Hamstern auch Antikörper nachgewiesen, die gegen die anderen beiden Kapsidproteine von HaPyV, VP2 und VP3, gerichtet sind. Die für diese Untersuchungen eingesetzten E. coli-exprimierten Dehydrofolatreduktase (DHFR)-Kapsidprotein-Fusionen sind zum Nachweis von VP1-, VP2- und VP3-spezifischen Antikörpern geeignet. Der Nachweis von VP2/VP3-spezifischen Antikörpern bei fast allen infizierten Tieren könnte zukünftig die Basis für die Entwicklung von DIVA (Differentiation of Infected and Vaccinated Animals)- basierten Diagnostik- und Vakzine-Verfahren darstellen, bei denen VP1-abgeleitete VLP als Vakzine eingesetzt werden. Beim ausschließlichen Nachweis von anti-VP1-Antikörpern würde es sich um das Ergebnis einer VP1-VLP-Vakzinierung handeln, während es sich beim zusätzlichen Nachweis von VP2- und VP3-spezifischen Antikörpern um eine Polyomavirus-Infektion handeln würde. Um die Kreuzreaktivität der Hefe- exprimierten VP1-Proteine von HaPyV und der humanpathogenen Polyomaviren BKPyV und JCPyV zu untersuchen, wurden Western Blot-Analysen und ELISA- Untersuchungen unter Verwendung von monospezifischen Kaninchenseren und Seren spontan HaPyV-infizierter Hamster durchgeführt. Hierbei zeigte sich, wie erwartet, für alle untersuchten Polyomaviren eine, wenn auch zum Teil schwache Kreuzreaktivität. Die beobachtete Kreuzreaktivität zwischen VLP verschiedener Polyomaviren könnte bei einer mehrfachen Applikation von HaPyV-abgeleiteten VLP in der Gentherapie ein Problem darstellen, das jedoch möglicherweise durch gentechnische Modifikation immundominanter Epitope im HaPyV-VP1 oder durch Verwendung von VLP unterschiedlicher Polyomaviren gelöst werden könnte.

Hereditary diseases are a major challenge for human medicine. The aim of somatic gene therapy is to repair a defective or improperly regulated gene by insertion of an intact gene sequence. Besides the application of gene therapy methods for treatment of monogenic diseases, somatic gene therapy will also be introduced for the treatment of cancer and chronic viral infections. Different methods have been developed for the transmission of the transgene in vivo, ex vivo and in vitro. The methods offer different advantages and disadvantages in terms of packaging capacity, immunity, application method and security. One promising possibility of gene therapy is the use of virus-like particles (VLPs). A possible starting point for the development of VLPs for gene therapy, the major capsid is VP1 of Hamsterpolyomavirus (HaPyV), which assembles to VLP after heterologous expression in yeast Saccharomyces cerevisiae. One target of this work was the establishment of methods for encapsidation of DNA into foreign plasmid HaPyV-derived VLPs and to demonstrate the successful packaging of DNA. For this purpose, an already established system for synthesis and purification of yeast-expressed VP1-VLP- HaPyV used which contain the viral capsid protein VP1. The method developed here for the packaging of DNA foreign plasmid is the dissociation of the VLP, adding the plasmid DNA and reassociation of the VLP. For the detection of VLP reassembly and the associated packaging of plasmid DNA, various methods were examined. The association of VLPs with nucleic acid can be detected with the help of gel electrophoresis easily. An additional DNase treatment and subsequent agarose gel electrophoresis analysis confirmed the protection of the packaged plasmid compared to the DNase action, so that it can be assumed that the encapsidation of the plasmid in reassembled VLP was successful. The detection of a reassembly of VLPs could be produced by electron microscopy. In contrast, a haemagglutionation test is not suitable for the differentiation of dissociated and reassembled VLPs. A second focus of the work was in the immunological characterization of the VLP of different polyomaviruses, in order to assess possible negative effects of a pre-existing polyomavirus- specific immunity. Of crucial importance for the use of VLP-derived HaPyV for human gene therapy is the possible cross-reactivity of HaPyV-VP1and the human polyomaviruses and especially because of the high seroprevalence of the population with human pathogenic polyomaviruses (BK polyomavirus 90% and JC polyomavirus 70%). Because of the large sequence similarity of the VP1 proteins of different polyomaviruses a strong cross-reactivity must be assumed. In all tested, spontaneously-infected Syrian hamsters HaPyV demonstrated the formation of VP1-specific antibodies. In addition, almost all infected hamsters also showed evidence of antibodies directed against the capsid proteins of two other HaPyV, VP2 and VP3. The studies used for this E. coli-expressed dehydrofolate (DHFR)-capsid protein fusions are suitable for the detection of VP1, VP2 and VP3-specific antibodies. The detection of VP2/VP3-specific antibodies in almost all infected animals may be the basis for the development of DIVA (Differentiating Infected and Vaccinated Animals Of) - based diagnostics and vaccines represent process, in which VP1-derived VLPs used as a vaccine. The exclusive detection of anti-VP1 antibodies, it would be either the result of a VP1-VLP vaccination, while there would be additional proof of the VP2 and VP3-specific antibodies to a polyomavirus infection. To examine the cross-reactivity of yeast-expressed VP1 proteins of the human pathogenic polyomaviruses and HaPyV BKPyV and JCPyV, Western Blot analysis and ELISA studies using monospecific rabbit and hamster-infected sera spontaneously HaPyV were performed. The results showed, as expected, for all investigated polyomaviruses sometimes weak cross-reactivity. The observed cross-reactivity between VLPs of different polyomaviruses could be problematic while multiple application of HaPyV-derived VLPs in gene therapy, a problem that could possibly be solved, however, by genetic modification immunodominant epitopes in the VP1-HaPyV or through the use of VLPs of different polyomaviruses.