Durchflusszytometrische Untersuchungen zur Expression von Zytokinrezeptoren und apoptoserelevanter Antigene bei der B-CLL

Abstract

Die chronische lymphatische Leukämie wird nach der derzeit favorisierten Hypothese laut Federico Caligaris-Cappio, Turin/Italien, als akkumulative Störung auf dem Boden einer Fehlregulation apoptotischer Signale angesehen. Eine Vielzahl verschiedener Mechanismen, welche zur gestörten Apoptose der B -CLL-Zellen führen könnten, wurden bisher vorgeschlagen. Die vorliegende Arbeit untersuchte die Expression bestimmter Oberflächenmoleküle, welchen bedeutende Rollen in der Umgehung des natürlichen Zelltodes zugesprochen werden. Hierfür wurde peripheres Blut von 27 CLL-Patienten und 9 gesunden Kontrollpersonen mithilfe der Mehrfarbenimmunfluoreszenz durchflußzytometrisch analysiert. Die Zellseparation der interessierenden Lymphozyten erfolgte mittels der Erythrozyten-Lyse und der Anwendung des Gating -Verfahrens. Zur Analyse der für die Arbeit relevanten Antigenexpressionen wurde ein aus 13 unterschiedlichen monoklonalen Antikörpern bestehendes Panel hinzugezogen. Dabei wurden jedem Proberöhrchen jeweils drei verschiedene Antikörper hinzugegeben. Anschließend erfolgte am Durchflußzytometer je Proberöhrchen die Datenerhebung von 10000 Zellen bei den CLL-Patienten beziehungsweise 50000 bei den gesunden Probanden. Die mittels Quadranten- und Histogrammstatistiken ermittelten prozentualen Anteile der jeweiligen antigenexprimierenden Zellen wurden anschließend unter Zuhilfenahme statistischer Tests auf signifikante Unterschiede bezüglich der Gruppen der CLL-Patienten und der Kontrollpersonen geprüft. Signifikant erhöhte Anteile konnten bei den CLL-Patienten erwartungsgemäß für CD5 und CD19 bestimmt werden. Das Vorliegen eines erhöhten Anteils CD5 positiver B-Lymphozyten, einem wichtigen Merkmal der B-CLL, konnte erst durch die zusätzliche Betrachtung der Koexpression von CD5 und CD19 bestimmt werden. Auch diese führte zu einer hoch signifikanten Erhöhung in der Patientengruppe. Für das Oberflächenadhäsionsmolekül CD52 wurde für die B-Lymphozyten beider Gruppen eine konstante Expression von jeweils über 99 % ermittelt. Diese fast durchgängige Expression von CD52 auf B-Lymphozyten stellt eine wichtige Voraussetzung neuer immuntherapeutischer Strategien der B-CLL mithilfe monoklonaler Antikörper dar. Bezüglich des Apo-1/Fas-Antigens (CD95) sollte untersucht werden, ob auf leukämischen B-Zellen eine verminderte Expression dieses apoptoseregulierenden Moleküls nachzuweisen ist. Dies wäre ein Hinweis auf eine durch Down-Regulation von CD95 erreichte Minderempfindlichkeit für Apoptosesignale. Tatsächlich konnte in unseren Dot- Plot-Auswertungen für die Gruppe der CLL-Patienten eine signifikant erniedrigte Expression dieses Markers beobachtet werden. Außerdem konnte nach Erstellung einer Receiver-Operating-Kurve und Ermittlung eines optimalen Schwellenwertes in einem sich anschließenden Vierfelder-Test ein signifikantes Ergebnis ermittelt werden. Die Histogramm-Auswertungen für CD95 lieferten jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Untersuchungsgruppen. Des Weiteren wurden die Expressionen des IFN-γ-Rezeptors (CD119) und des IL-4-Rezeptors (CD124) hinsichtlich einer möglichen Hochregulierung auf malignen B-Zellen untersucht. Eine Überexpression dieser Oberflächenmarker könnte auf eine hierdurch erreichte Überempfindlichkeit für apoptosehemmende Signale ihrer Liganden hinweisen. Bezüglich des IFN-γ-Rezeptors lieferten unsere Ergebnisse keinen Anhalt für diese Annahme. Sowohl in den Dot-Plot-Auswertungen als auch in den Histogramm-Auswertungen konnte kein signifikanter Unterschied der Expressionen zwischen den beiden Gruppen festgestellt werden. Anders verhielt es sich für den IL-4-Rezeptor. Hier wurde in beiden Auswertungsverfahren für die CLL-Patienten jeweils eine hoch signifikante Überexpression von CD124 ermittelt. Auch anschließende Vierfelder-Tests lieferten für zwei gewählte Schwellenwerte signifikante Unterschiede. In einer abschließenden Korrelationsanalyse konnte mit Hilfe eines Punktwolken-Diagramms ein tendenzieller Zusammenhang zwischen den Expressionen von CD95 und CD124 nachgewiesen werden. Dabei korrelierte bei den CLL-Patienten eine sinkende Expression des Fas-Antigens mit einer steigenden des IL-4-Rezeptors. Zusammenfassend lieferten unsere Untersuchungen Hinweise für bestimmte Pathomechanismen der Apoptosehemmung bei der CLL, welche in zukünftigen therapeutischen Strategien der chronisch lymphatischen Leukämie wichtige Angriffspunkte darstellen könnten.

The chronic lymphocytic leukaemia is according to the presently favourite hypothesis from Federico Caligaris-Cappio, Turin/Italy, regarded as an accumulative dysfunction, based on a defective regulation of apoptotic signals. A variety of different mechanisms, which could cause the defective apoptosis of the B-CLL-cells, have been suggested. The work at hand analysed the expressions of certain molecules on cell-surface, which are awarded eminent roles in the avoiding of programmed cell-death. We analysed peripheral blood from 27 CLL-patients and 9 healthy test-persons with the aid of flowcytometry. The cells separation of the interesting lymphocytes was made by erythrocytes-lyses and with the aid of the gating -method. A panel of 13 different monoclonal antibodies was utilised for the analysis of the relevant antigen-expressions. Therefore three different antibodies were added to every test-tube. Afterwards we performed data collection from respectively 10.000 cells of CLL-patients and 50.000 cells of test-persons by flowcytometry. Using quadrant- and histogram-statistics the determined percentages of antigen- expressions were proofed with the aid of statistical tests respectively significant differences among the groups of CLL-patients and test-probands. As expected, significant raised proportions for CD5 and CD19 could be shown for the CLL-patients. The existence of a raised proportion of CD5-positive B-lymphocytes, an important criterion of B-CLL, could be analysed by the examination of co-expression of CD5 and CD19. This analysis also showed significantly raised proportions in the CLL-group. Furthermore, in both examination groups a constant expression of each more than 99% could be determined for the molecule CD52 on B-lymphocytes. This nearly continuous expression of CD52 on B-lymphocytes is an important precondition of new immunotherapeutic strategies with the aid of monoclonal antibodies. Concerning the Apo1/Fas-antigen (CD95) we wanted to analyse, if a diminished expression of this apoptosis-regulative molecule can be shown on leucaemic B-cells. This would be an evidence for a diminished sensitivity for signals of apoptosis due to a down-regulation of the Apo1/Fas-receptor. Actually we could find in our dot-plot-analysis a significant diminished expression of this antigen in the group of CLL-patients. Furthermore, there could be shown a significant result respectively a threshold value of 6% expression of CD95. In the histogram- statistics though, there couldn t be found significant differences between the two examination-groups. In addition, we analysed the expression of the IFN-γ-receptor (CD119) and the IL-4-receptor (CD124) concerning a potential up-regulation on B-CLL-cells. An over-expression of these two markers could suggest a hereby achieved hypersensitivity for the apoptosis-repressive signals of their ligands. In terms of the IFN-γ-receptor our results didn t provide evidence for this presumption. On the other hand, concerning the IL-4-receptor, we could investigate both in the quadrant-statistics and in the histogram-statistics significant over-expressions in the CLL-group. In an closing analysis of correlation between the antigen-expressions of CD95 and CD124 our results showed, that a decreasing expression of the Fas-antigen tends toward an increasing expression of the IL-4-receptor in the CLL-group. Recapulating, our examinations provides indications of certain pathomechanisms of inhibition of apoptosis in the CLL, which could represent important points of attack in future therapeutic strategies of the CLL.