The molecular mechanisms of endogenous human skin aging

Abstract

To decipher the molecular mechanisms involved in endogenous skin aging human skin cells were maintained with GH, IGF-I, 17β-estradiol, progesterone, testosterone and DHEA at levels corresponding to average serum levels of males and females from 20 to 60 years of age. First, the expression of the corresponding receptors were identified by RT-PCR, Western blotting and immunocytochemistry. The biological activity of the skin cells under hormone treatment was evaluated by measuring the lipid synthesis, the cell proliferation and viability by means of nile red-microassay, MUH- and LDH- assay, respectively. SZ95 sebocytes incubated with the hormone mixture circulating in 60-y-old individuals showed significantly lower content of neutral lipids than cells treated with hormones of 20-y-old ones. On the other hand, proliferation of the fibroblasts was significantly affected by the hormone mixture, and fibroblasts incubated with hormones of 60-y-old individuals showed lower content of neutral and polar lipids than cells treated with hormones of 20-y-old ones. The mRNA and protein expression of two aging-associated genes- c-Myc and fibronectin- was measured via Northern and Western blotting, accordingly. Increased mRNA and protein levels of c-Myc and increased protein levels of fibronectin were detected in SZ95 sebocytes at 60-y-old hormone levels compared to those detected at 20-y-old hormone levels. Expression profiling employing a cDNA microarray composed of 15,529 cDNAs from known and novel genes identified age-related genes with altered expression levels at 20 and 60 years. The functional classification of these genes were related to several biological processes such as in mitochondrial function, oxidative damage and stress, ubiquitine-mediated proteolysis, cell cycle, immune responses, organization of the extracellular matrix, steroid biosynthesis and phospholipid degradation, which are all hallmarks of the aging process. Furthermore, the effects of the hormones were tested as single agents. In SZ95 sebocytes, while IGF-I and GH were shown to amplify neutral and polar lipid synthesis, 17β-estradiol and testosterone showed mostly an effect on polar lipid production. After treatment with progesterone and DHEA no effect was detected. Proliferation and cytotoxicity remained by all hormones tested unchanged. On the other hand, IGF-I and 17β-estradiol enhanced fibroblast proliferation and could also amplify lipid synthesis in a dose- dependent manner. In addition, in the experiments presented here, an interaction between IGF-I and estradiol signaling pathways was documented in SZ95 sebocytes and fibroblasts, which also gave evidence for a paracrine interaction between both cell types in vivo. IGF-I induced 17β-estradiol synthesis in SZ95 sebocytes and fibroblasts, while 17β-estradiol stimulated IGF-I synthesis only in fibroblasts. Moreover, IGF-IR and ERα expression in SZ95 sebocytes and IGF-IR expression in fibroblasts was shown to be influenced by 17β-estradiol and IGF-I in a time-dependent manner. These data indicate how important hormones can be for the development of human cells, as they can regulate their biological activity and the pattern of their gene expression. Moreover, this in vitro model on endogenous skin aging may serve in the identification of skin aging- but also global aging-associated genes facilitating future studies on molecular aging.

Zur Entschlüsselung der molekularen Mechanismen, die an der endogenen Hautalterung beteiligt sind, wurde ein in vitro Alterungsmodel entwickelt. Humane Hautzellen wurden mit einer Hormonmischung behandelt, die aus Wachstumshormon (GH), Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor-I (IGF-I), 17β- Estradiol, Progesteron, Testosteron und Dehydroepiandrosteron (DHEA) zusammengesetzt war. Die gewählten Konzentrationen entsprachen denen, die in 20- und 60-jährigen Männern bzw. Frauen zirkulierend vorkommen. Die Expression der entsprechenden Rezeptoren auf mRNS und Proteinebene wurde mittels RT-PCR, Western-Blot und Immunzytochemie nachgewiesen. Zur Bestimmung der biologischen Aktivität der Hautzellen wurde die Lipidsynthese mittels Nilrot-Microassay bzw. Fluoreszenzmikroskopie, die Zellproliferation mittels 4 -Methylumbelliferyl-Heptanoat-Assay und die Lebensfähigkeit mit Hilfe von Lactatdehydrogenase-Assay gemessen. SZ95 Sebozyten behandelt mit Hormonmischungen in Konzentrationen, die in 60-jährigen zirkulierend vorkommen, zeigten eine signifikant reduzierte Produktion der neutralen Lipide im Vergleich zu den Zellen, die mit Hormonen behandelt wurden, die in 20-jährigen zirkulieren. Nach Inkubation von Fibroblasten zeigte sich eine signifikant geringere Synthese von neutralen und polaren Lipiden in den Zellen behandelt mit der 60-jährigen Hormonmischung. Die Fibroblastenproliferation war unter allen Behandlungen signifikant erhöht. Weiterhin wurde eine erhöhte mRNS und Proteinexpression von c-Myc und eine erhöhte Proteinexpression von Fibronektin in den hormonell gealterten SZ95 Sebozyten mittels Northern- bzw. Western-Blot detektiert. Beide Gene sind in mehreren Studien mit dem Alterungsprozess assoziiert worden. Mit Hilfe eines cDNS-Microarrays wurde nach Behandlung von SZ95 Sebozyten mit den entsprechenden Hormonmischungen die Expression von 15,529 Genen analysiert. Dabei wurden alterungsassoziierte Gene identifiziert, die eine differentielle Expression nach 20- bzw. 60-jähriger Hormonbehandlung zeigten. Die funktionelle Klassifikation dieser Gene korrelierte mit biologischen Prozessen wie mit der mitochondrialen Funktion, dem oxidativen Stress, der Ubiquitin-assoziierten Proteolyse, dem Zellzyklus, der Immunantwort, der Organisation des extrazellulären Matrix, der Steroidbiosynthese und der Phospholipiddegradation. Des Weiteren wurden die Wirkungen der einzelnen Hormone auf die SZ95 Sebozyten und Fibroblasten untersucht. Während IGF-I und GH die neutralen und die polaren Lipide in den SZ95 Sebozyten amplifizieren konnten, zeigten 17β-Estradiol und Testosteron einen Effekt nur auf die polare Lipidsynthese. Nach Behandlung mit Progesteron und DHEA wurde kein Effekt nachgewiesen. Die Proliferation und die Lebensfähigkeit blieben unter allen Hormonbehandlungen unverändert. Auf der anderen Seite induzierten IGF-I und 17β-Estradiol die Fibroblastenproliferation und deren Lipidsynthese. Allerdings zeigte es sich mittels ELISA, dass IGF-I die 17β-Estradiol Synthese in SZ95 Sebozyten und Fibroblasten stimulieren konnte, während 17β-Estradiol die IGF-I Synthese in Fibroblasten induzieren konnte. Die Expression vom IGF-I Rezeptor (IGF-IR) und Estrogenrezeptor α (ERα) in SZ95 Sebozyten und die IGF-IR Expression in Fibroblasten war unter jeweiliger Gabe von 17β-Estradiol und IGF-I beeinflusst. Diese Befunde sprachen für eine Wechselwirkung zwischen der IGF-I und 17β-Estradiol Signalkaskade. Zusammenfassend, diese Ergebnisse zeigen, dass altersbedingte hormonelle Veränderungen die Genexpression und die biologische Aktivität der Hautzellen beeinflussen können. Weiterhin könnte das beschriebene in vitro-Alterungsmodel zur Erforschung der endokrinen Hautalterung und der Identifikation von alterungsassoziierten Genen dienen.