Fabrication and characterization of hemoglobin based oxygen carriers

Abstract

Currently, extensive research has been performed to design a suitable blood substitute. Most of these approaches have focused on the development of Hb-based oxygen carriers (HBOCs). HBOCs represent a propitious type of blood substitute to transport oxygen throughout the body while also acting as a carrier in biomedical applications. Although HBOCs have been developed and clinically investigated, it remains some safety concerns such as short circulatory half-life, oxidative stress, hypertension, etc. Due to HBOCs in blood are recognized and are rapidly scavenged by the innate immune systems, HBOCs require a surface modification that provides protection against detection and elimination in order to prolong circulation time. In this study, we fabricated hemoglobin submicroparticles (HbMPs) using the CCD technique as HBOCs and investigated different surface modification of HbMPs. Double/triple precipitation as well as adsorption of human serum albumin, hyaluronic acid and pluronic were applied. The influence of these surface modifications was investigated determining the functional Hb and the binding of anti-Hb antibodies, immunoglobulin and haptoglobin to HbMPs. Additionally, we fabricated and characterized HbMPs by incorporation of polydopamine in order to protect Hb against oxidation. Finally, we established a novel fabrication process of HbMPs using oxidized-dextran as cross-linker and characterized their properties. The particle size, zeta-potential and morphology of all synthesized HbMPs were analyzed using zeta sizer, CLSM, SEM, and TEM. The results revealed that all fabricated HbMPs have a submicron size with a negative charge in PBS. For the functional Hb, there are no significant dif-ferences between surface-modified HbMPs and Odex-HbMPs. The functional Hb of PD-HbMPs was shown twice higher than unmodified HbMPs due to the protective antioxidant effect of PD. The specific binding of anti-Hb antibodies, immunoglobulin and haptoglobin to the surface-modified HbMPs was reduced. This indicates that the particles are protected again detection and elimination processes by the immune system and therefore it can be assumed that the circulation half-life will increased. The PD-HbMPs illustrated a high scavenging activity of free radicals including H2O2, suggesting promising HBOCs with antioxidation activity. The new fabrication technique of Odex-HbMPs minimizes the fabrica-tion time and is a very efficient fabrication method. Odex-HbMPs maintained their ability to be oxygenat-ed/deoxygenated and they are stable at least for 90 days. The results presented in this work suggest a great potential of HbMPs to become useful HBOCs.

Gegenwärtig wurden umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um eine geeignete und alternative Quelle für Blutblutersatz zu finden. Die meisten dieser Ansätze haben sich auf die Entwicklung von Hb-basierten Sauerstoffträgern (HBOCs) konzentriert. HBOCs stellen eine günstige Art von Blutersatz dar, um Sauerstoff durch den Körper zu transportieren und gleichzeitig als Träger in biomedizinischen Anwendungen zu fungieren. Obwohl HBOCs entwickelt und klinisch untersucht wurden, müssen nach der Infusion weitere Sicherheitsaspekte beachtet werden, wie z. B. kurze Kreislaufhalbwertszeit, oxidativer Stress, Bluthochdruck usw. HBOCs im Blut werden erkannt und werden vom angeborenen Immunsystem schnell abgefangen. Oberflächenmodifikationen, die vor dem Erkennen und der Elemination der HBOCs schützen, sollen die Zirkulationszeit verlängern. Wir untersuchten verschiedene Oberflächenmodifikationen von Hämoglobin-Mikropartikeln (HbMPs) durch Doppel- / Dreifachpräzipitation sowie durch Adsorption von Humanserumalbumin, Hyaluronsäure und Pluronsäure unter Verwendung der CCD-Technik, um herauszufinden, wie die verschiedenen Oberflächenmodifikationen die Funktion von Hb und die Bindung von Anti-Hb-Antikörpern, Immunglobulin und Haptoglobin an HbMPs beeinflussen. Zusätzlich stellten wir HbMPs her und charakterisierten sie, indem wir Dopamin in den HbMP polymerisierten, um Hb vor Oxidation zu schützen. Schließlich wurde ein neues Herstellungsverfahren für HbMPs unter Verwendung von oxidiertem Dextran als Vernetzer etabliert und die Eigenschaften der Odex-HbMP charakterisiert. Die Partikelgröße, das Zeta potential und die Morphologie aller hergestellten HbMPs wurden unter Verwendung des Zetasizers, CLSM, SEM und TEM analysiert. Die Ergebnisse zeigten, dass alle hergestellten HbMPs eine Größe im Submikronbereich mit einer negativen Ladung in PBS aufweisen. Für das funktionelle Hb wurden keinen signifikanten Unterschied zwischen oberflächenmodifizierten HbMPs und Odex-HbMPs gefunden. Das funktionelle Hb von PD-HbMPs war aufgrund der schützenden antioxidativen Wirkung von PD doppelt so hoch wie das in unmodifizierten HbMP. Die spezifische Bindung von Anti-Hb-Antikörpern, Immunglobulin und Haptoglobin war bei den oberflächenmodifizierten HbMPs reduziert. Dies deutet auf ein Beschichtungsdesign hin, das in der Lage ist, die Partikel vor dem Nachweis und den Eliminierungsprozessen durch das Immunsystem zu schützen, und daher kann davon ausgegangen werden, dass es zu einer Verlängerung der Halbwertszeit im Blutkreislauf kommen wird. Die PD-HbMPs besitzen eine hohe Aktivität freie Radikale, einschließlich H2O2 zu eliminieren, womit HBOCs mit Antioxidationsaktivität zur Verfügung stehen. Die neue Herstellungstechnik von Odex-HbMPs minimiert die Herstellungszeit und bietet eine sehr effiziente Herstellungsmethode. Odex-HbMPs konservieren ihre Fähigkeit zur Sauerstoffbindung/Sauerstoffabgabe und sind mindestens 90 Tage lang stabil. Insgesamt können die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse als Beleg für ein großes Potenzial der HbMPs als künstliche Sauerstofftransporter betrachtet werden.