Ein ATP-abhängiger Regulationsmechanismus in einem Proteinkomplex der DNA- Reparatur

Abstract

Die DNA-Reparatur durch "base excision repair" (BER) schützt die Zelle vor allgegenwärtigen DNA-Schäden. Dabei werden beschädigte DNA-Basen durch neu synthetisierte DNA ersetzt. Es existieren zwei Teilmechanismen von BER, die sich in der DNA-Synthese unterscheiden. Bei "short patch BER" baut DNA- Polymerase beta (Pol beta) nur ein Nukleotid ein. Bei "long patch BER" synthetisiert Pol beta einen längeren DNA-Strang. DNA-Ligase III (Lig III) verschließt den verbleibenden DNA-Einzelstrangbruch in einer ATP-abhängigen Reaktion. Die Regulation des Wechsels zwischen den beiden BER-Mechanismen war noch weitgehend ungeklärt. Das Enzym Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP-1) und das Protein "x-ray repair cross-complementing 1" (XRCC1) sind ebenfalls an BER beteiligt, ihre Funktionen bei diesem Prozess sind jedoch nur unzureichend erforscht. Im Vorfeld dieser Arbeit wurde beobachtet, dass zellulärer ATP- Mangel mit erhöhten Aktivitäten von PARP-1 und Pol beta einhergeht. Dies wies erstmals auf eine energieabhängige Regulation des BER-Mechanismus hin. Die vorliegende Arbeit befasst sich daher mit dem Einfluss der Energiesituation auf den BER-Mechanismus. Die Proteine des BER-Komplexes wurden rekombinant überexprimiert und isoliert (Pol beta, Lig III, XRCC1, PARP-1; zusätzlich AP- Endonuklease 1 und Flap-Endonuklease 1). Die DNA-Reparatur durch BER wurde mit diesen Proteinen in vitro rekonstruiert. Der Einfluss von ATP auf die Aktivitäten von PARP-1 und Pol beta sowie auf den BER-Mechanismus wurde analysiert. Dabei wurde speziell die Bedeutung von Lig III und XRCC1 für die Regulation des BER-Mechanismus untersucht. Um die Rolle der Lig III-Aktivität zu analysieren, wurden durch gerichtete Mutagenese zwei katalytisch inaktive Mutanten von Lig III erzeugt. Anhand von menschlichen Zellkernextrakten wurde die Bedeutung von "long patch BER" bei Energiemangel untersucht. Auf diese Weise konnte eine neuartige, energieabhängige Regulation von BER nachgewiesen werden. Bei Verfügbarkeit von ATP überwiegt Reparatur durch "short patch BER", bei ATP-Mangel erfolgt dagegen verstärkt "long patch BER". Bei Energiemangel begünstigt "long patch BER" die DNA-Ligation. ATP hemmt sowohl die PARP-1-Aktivität als auch die DNA-Synthese durch Pol beta. Die ATP-abhängige Hemmung von Pol beta wird durch die katalytische Aktivität von Lig III vermittelt, die ATP benötigt. Zudem zeigte die gerichtete Mutagenese von Lig III erstmals eine Rolle von Lysin 421 und Aspartat 423 bei der DNA-Bindung dieses Enzyms. XRCC1 stimuliert die "strand displacement"-DNA-Synthese durch Pol beta und koordiniert die Aktivitäten von Pol beta und Lig III. Aufgrund dieser Koordinationsfunktion stimuliert XRCC1 "short patch BER" bei Verfügbarkeit von ATP und "long patch BER" bei ATP-Mangel. Die hier präsentierten Ergebnisse stellen einen bedeutenden Fortschritt für das Verständnis der Regulation des BER-Mechanismus und der Funktionen der beteiligten Proteine dar.

DNA repair by base excision repair (BER) protects cells from regularly occurring DNA damage. This mechanism replaces damaged DNA bases with newly synthesized DNA. Two sub-pathways of BER are known which differ in the DNA synthesis step. During short patch BER, DNA polymerase beta (Pol beta) incorporates only one nucleotide. During long patch BER, Pol beta synthesizes a longer DNA strand. The remaining DNA single strand break is sealed by DNA ligase III (Lig III) in an ATP-dependent reaction. The regulation of the switch between the two BER mechanisms was largely unexplored. The enzyme poly (ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) and the protein x-ray repair cross- complementing 1 (XRCC1) also participate in BER. Their functions in this process still deserve study. Prior to this study it was observed that cellular ATP depletion is accompanied by increased activities of PARP-1 and Pol beta. This indicated an energy-dependent regulation of the BER mechanism for the first time. This study deals with the influence of the energy situation on the BER mechanism. Recombinant proteins of the BER complex were overexpressed and isolated (Pol beta, Lig III, XRCC1, PARP-1; additionally AP endonuclease 1 and flap endonuclease 1). Using these proteins, repair of DNA by BER was reconstituted in vitro. Thereby the influence of ATP on the activities of PARP-1 and Pol beta and on the BER mechanism was analyzed. The respective impacts of Lig III and XRCC1 on the regulation of BER were investigated. In order to clearly analyze the influence of the Lig III activity, two inactive mutants of Lig III were generated by site directed mutagenesis. Using nuclear extracts of human cells, the relevance of long patch BER in situations of energy depletion was investigated. Thus a novel energy-dependent regulation of BER could be demonstrated. If ATP is available, repair through short patch BER predominates. If ATP is lacking, repair through long patch BER is increased. Long patch BER facilitates DNA ligation in situations of energy depletion. ATP inhibits the activity of PARP-1 as well as DNA synthesis by Pol beta. The ATP- dependent inhibition of Pol beta is mediated through the catalytic activity of Lig III which depends on ATP. In addition, the site directed mutagenesis of Lig III revealed novel roles for lysine 421 and aspartate 423 in the binding of this enzyme to DNA. XRCC1 stimulates strand displacement DNA synthesis by Pol beta and coordinates the activities of Pol beta and Lig III. By means of this coordinating function, XRCC1 is able to stimulate short patch BER if ATP is available and long patch BER if ATP is lacking. The data presented here represent a substantial progress in understanding the regulation of BER and the functions of the participating proteins.