Traumatic brain injury and bone healing: histomorphometric analyses of bone formation in a wild-type and leptin-deficiency murine model

Abstract

Introduction: It is empirically documented that the combination of traumatic brain injury (TBI) and bone fracture results in an increase of callus formation. However, the underlying mechanisms of this phenomenon have not yet been elucidated. Leptin, which was initially recognized as the regulator of food intake and energy metabolism, has also proven to be important in bone metabolism. In this study, we analyzed fracture healing both with and without concomitant TBI, and qualitative and quantitative histomorphometric analyses were employed on wild-type and leptin-deficiency (ob/ob) mice. We established vivid evidence for the positive effect of TBI on fracture healing as well as the influence of leptin in fracture healing after TBI. Materials and Methods: 34 female wild-type mice and 31 female ob/ob mice were classified into fracture (wild-type: n = 17, ob/ob: n = 16) and fracture with TBI (wild-type: n = 17, ob/ob: n = 15) subgroups respectively. The fracture was performed as a 0.7 mm gap osteotomy at the left femur followed by external fixation. TBI was induced at the left cortex with a standard controlled cortical impact. The animals were sacrificed at week 3 and week 4 post-operation. For qualitative (bone bridging score) and quantitative histomorphometric analyses (mineralized bone area and density (MdBAr and MdBDn), trabecular microarchitecture), Movat staining was implemented. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining was performed for osteoblast and osteoclast density analyses. Results: The group that combined fracture with TBI showed a significant increase of MdBAr and MdBDn, especially in the periosteal area in wild-type mice at week 4 compared with the fracture-only group. However, there were no statistical differences in wild-type mice between the fracture group and fracture with TBI group in osteoblast and osteoclast density. In terms of fracture healing, ob/ob mice presented compromised bridging score, MdBAr and MdBDn, and osteoblast and osteoclast density compared with the wild-type mice at week 3 and 4. In the ob/ob phenotype, there were no significant differences between the fracture and fracture with TBI groups in bridging score, MdBAr and MdBDn, and osteoblast and osteoclast density in either week 3 or 4. Conclusion: The positive effect of TBI on fracture healing in wild-type mice was confirmed, while compromised fracture healing in ob/ob mice was also observed. Moreover, TBI did not reverse the negative effect of leptin deficiency on fracture healing. Based on these findings, we suggest leptin to be involved in the acceleration of fracture healing following the signaling cascade of TBI.

Einleitung: In der Klinik sowie in Tiermodellen wurde seit langem eine gesteigerte Kallusbildung und eine damit verbundene verbesserte Knochenheilung nach Schädel-Hirn-Trauma (SHT) beobachtet. Allerdings war der zugrundeliegende Mechanismus des Phänomens bis heute ungeklärt. In diesem Zusammenhang rückt Leptin durch seine nachweisliche wichtige Rolle in der Knochenentwicklung und dem Knochenmetabolismus in den Vordergrund. In dieser Arbeit konnte eine verbesserte Frakturheilung nach SHT durch qualitative und quantitative histomorphometrische Analysen in Wildtyp Mäusen bestätigt werden und der Einfluss von Leptin in der Frakturheilung nach SHT überprüft werden. Materialien und Methoden: Es wurden 34 weibliche Wildtyp und 31 ob/ob Mäuse in Fraktur (Wildtyp n = 17, ob/ob n = 16) und Fraktur mit SHT (Wildtyp n = 17, ob/ob n = 15) Gruppen eingeteilt. Die Fraktur wurde durch eine 0,7 mm Spalt-Osteotomie im linken Femur und anschließende externe Fixierung durchgeführt. Das SHT wurde durch einen controlled cortical impact (CCT) im linken Cortex induziert. Drei und vier Wochen nach der Operation wurden die Tiere geopfert. Für qualitative (Knochenüberbrückungsscore) und quantitative histomorphometrische Analysen (mineralisierte Knochenfläche und -dichte, trabekuläre Mikroarchitektur) wurde eine Movat-Pentachrom-Färbung durchgeführt. Mittels einer Tartrate-resistant acid phasphatase (TRAP) Färbung wurde die Dichte von Osteoblasten und Osteoklasten bestimmt. Ergebnisse: Bei den Wildtyp Mäusen mit einer kombinierten Verletzung konnte ein signifikanter Anstieg in der mineralisierten Knochenfläche und -dichte im Vergleich zur Fraktur Gruppe beobachtet werden. Dieser war besonders ausgeprägt in der periostealen Fläche vier Wochen postoperativ. Es wurden keine weiteren statistischen Unterschiede bei den Osteoblasten und Osteoklasten zwischen den untersuchten Gruppen der Wildtyp Mäuse gefunden. Im Frakturmodel wurde gezeigt, dass ob/ob Mäuse einen verringerten Knochenüberbrückungsscore, mineralisierte Knochenfläche und -dichte, Osteoblasten und Osteklasten Dichte verglichen zu Wildtyp Mäusen drei und vier Wochen postoperativ aufweisen. Innerhalb der Gruppen des ob/ob Phänotyps gab es keine signifikanten Unterschiede zwischen der Fraktur und der Fraktur mit SHT Gruppe in Knochenüberbrückungsscore, mineralisierter Knochenfläche und -dichte sowie in Osteoblasten- und Osteoklastendichte drei und vier Wochen nach Induktion von Fraktur und SHT. Schlussfolgerung: Der positiv Effekt von SHT auf die Knochenheilung in Wildtyp Mäusen konnte bestätigt werden, sowie die beeinträchtigte Knochenheilung in ob/ob Mäusen. Des Weiteren, konnte ein SHT den Einfluss des fehlenden Leptins in der Knochenheilung nicht umkehren. Basierend auf diesen Ergebnissen vermuten wir eine wichtige Rolle von Leptin bei der SHT vermittelten Steigerung der Knochenheilung.