Der Einfluss des circadianen Rhythmus auf die Sensitivität von in vitro Testsystemen

Abstract

Nahezu jeder lichtsensitive Organismus folgt einem circadianen Rhythmus, der ihm eine Anpassung an tageszeitabhängige Veränderungen seiner Umwelt ermöglicht. Es handelt sich dabei um ein endogenes Zeitsystem, das auf Zellebene generiert wird und sowohl das Verhalten als auch die Physiologie rhythmisch reguliert. Zu den circadian regulierten physiologischen Prozessen gehört u.a. der Fremdstoffmetabolismus, so dass die toxikologische Wirkung von Xenobiotika zeitpunktabhängig variieren kann. Dieser Zeit-Wirkungs-Zusammenhang findet bereits in der Chronopharmakologie Beachtung, wird aber in der regulatorischen Toxikologie, die sich mit der Risikobewertung von Chemikalien beschäftigt, nur wenig berücksichtigt. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines circadianen in vitro Testsystems anhand dessen untersucht wurde, inwieweit ein in vitro rekonstituierter circadianer Rhythmus die Sensitivität eines Zellkultursystems erhöht. Des Weiteren wurde untersucht, ob zeit- und phasenabhängige Effekte der Response auf Xenobiotika in vitro abgebildet werden können. Als Proof of Concept wurde die Xenobiotika-vermittelte AHR-Aktivierung – als gängiger toxikologischer Endpunkt – nicht synchronisierter und synchronisierter humaner Brustepithelzellen (HME1) miteinander verglichen, nachdem eine potentielle Beeinträchtigung des Rhythmus durch die verwendeten Substanzen mittels circadianer Biolumineszenz-Reporterzellen ausgeschlossen werden konnte. Hier zeigte sich eine im Vergleich zu nicht synchronisierten Zellen erhöhte Induktion der AHR-responsiven Gene CYP1A1 und ALDH3A1 in synchronisierten Zellen nach 24-stündiger Behandlung mit AHR-Agonisten unterschiedlicher Substanzklassen. Diese synchronisationsabhängige Zellantwort konnte in einer weiteren humanen Brustepithelzelllinie (M13SV1) und zwei verschiedenen Darmkrebszelllinien (HCT116, Caco2) bestätigt werden. Außerdem zeigte sich ein rhythmischer Verlauf der CYP1A1-Induktion, die sowohl von der Behandlungsdauer als auch vom Behandlungszeitfenster abhing, wobei diese Zeitabhängigkeit bei niedrigen Dosen besonders ausgeprägt war. Des Weiteren ergab die Analyse der CYP1A1-Enzymaktivität der HME1-Zellen, dass sich die erhöhte transkriptionelle Response in synchronisierten Zellen ebenfalls auf funktionaler Ebene widerspiegelt. Initiale Untersuchungen des zugrundeliegenden Mechanismus weisen auf eine circadiane Regulation der CYP1A1-Promotoraktivität hin. Zusammengefasst konnte also gezeigt werden, dass sich der Zeitpunkt der Analyse essentiell auf das Testergebnis auswirkte, wobei dies v.a. bei geringen und damit toxikologisch relevanten Substanzkonzentrationen beobachtet wurde. Dies ermöglicht eine Optimierung von Testsystemen durch eine Ermittlung optimaler Behandlungszeitfenster, um maximal sensitive Zellantworten zu detektieren und damit die biologische Relevanz des Testsystems zu erhöhen. Der circadiane Rhythmus sollte also nicht nur in vivo sondern auch in vitro berücksichtigt werden, um die Gefährdungseinstufung von Industriechemikalien, Bioziden und Pestiziden bei biologisch und toxikologisch relevanten Substanzkonzentrationen zu verbessern.