Development and Characterization of a Predictive Cell-based Test Method for the Identification of Substances with Estrogenic Properties

Abstract

The endocrine system is an integral part during development and the regulation of various physiological processes in the human body. Dysregulation of the endocrine system has frequently been linked to the development of adverse health effects including cancer. Man-made chemicals that have the capacity to interfere with the endocrine system thereby eliciting adverse health effects (termed endocrine disrupting chemicals (EDC)) are therefore of high concern. Available in vitro assays that allow the identification and characterization of EDCs mainly provide information on mechanisms and pathways of endocrine activity. However, these assays usually do not cover functional endpoints that are predictive for adversity such as hormone-related tumor formation and progression, necessitating the use of complex in vivo studies that require high numbers of test animals. This thesis introduces the E-Morph Assay: a novel robust and predictive in vitro test method that allows the identification and characterization of chemicals that interfere with the estrogen signaling pathway. The development of this assay is based on the finding that estrogen signaling modulates the organization of adherens junctions (AJ) in the human MCF7 breast cancer cell line. The specificity of this effect to the estrogen receptor α (ERα) signaling pathway could be verified by inhibition and knock down studies targeting ERα, while modulation of the G-protein-coupled estrogen receptor 1 (GPER1) did not have any influence. It could further be shown that AJ reorganization is mediated by the ERα target gene Amphiregulin (AREG) involving a crosstalk with the epidermal growth factor receptor (EGFR) and the downstream RhoA and Src family kinase signaling pathways. These cancer-related signaling pathways support the mechanistic and clinical relevance of AJ organization to be used as a novel functional endpoint in the E-Morph Assay for high-content/high-throughput phenotypic screening. The development of a 96 well plate assay set-up and a pipeline for automated image acquisition and quantitative image analysis allows the rapid testing of chemicals at multiple concentrations. Pilot screening using a test set of 17 reference chemicals with known estrogenic properties demonstrated a high predictive capacity of the E-Morph Assay. In conclusion, the E-Morph Assay will provide a valuable in vitro screening method to identify and characterize chemicals with estrogenic activity using estrogen dependent changes in AJ organization as a functional readout.

Das endokrine System ist ein zentraler Bestandteil während der Entwicklung und sowie der Regulierung physiologischer Prozesse im menschlichen Körper. Eine Dysregulation des endokrinen Systems steht in Verbindung mit der Entwicklung verschiedener Krankheiten einschließlich Krebs. Vom Menschen hergestellte Chemikalien, die in der Lage sind, das endokrine System zu stören und dadurch nachteilige Auswirkungen auf die Gesundheit haben (als endokrin wirkende Chemikalien (EDC) bezeichnet), geben daher Anlass zur Sorge. Verfügbare in-vitro-Assays, mit denen EDCs identifiziert und charakterisiert werden können, liefern hauptsächlich Informationen über Mechanismen und Wege der endokrinen Aktivität. Diese Assays decken jedoch in der Regel keine funktionellen Endpunkte ab, die eine Vorhersage zur Krankheitsentwicklung wie hormonbedingte Tumorbildung ermöglichen. Daher müssen komplexe in-vivo-Studien durchgeführt werden, für die eine große Anzahl von Testtieren erforderlich ist. In dieser Arbeit wird der E-Morph-Assay vorgestellt: eine neue robuste und prädiktive in-vitro-Testmethode, mit der Chemikalien identifiziert werden können, die den Östrogensignalweg stören. Die Entwicklung dieses Assays basiert auf der Feststellung, dass der Östrogensignalweg die Organisation von Adherens Junctions (AJ) in der menschlichen MCF7 Brustkrebszelllinie verändert. Die Spezifität dieses Effekts für den Östrogenrezeptor α (ERα) Signalweg konnte durch Inhibitions- und Knock-Down-Studien verifiziert werden, während die Modulation des G-Protein-gekoppelten Östrogenrezeptors 1 (GPER1) keinen Einfluss hatte. Es konnte gezeigt werden, dass die AJ-Reorganisation durch das ERα-Zielgen Amphiregulin (AREG) vermittelt wird. Zusätzlich sind der epidermalen Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) und nachgeschaltete Kinase-Signalwege der RhoA- und Src-Familie beteiligt. Diese krebsrelevanten Signalwege unterstützen die mechanistische und klinische Relevanz der AJ-Organisation als neuen funktionellen Endpunkt im E-Morph-Assay. Die Entwicklung einer Pipeline für die automatisierte Bilderfassung und quantitative Bildanalyse ermöglicht das schnelle Analysieren von Chemikalien. Das Testen von 17 Referenzchemikalien mit bekannten östrogenen Eigenschaften zeigte eine hohe Vorhersagekapazität des E-Morph-Assays.