Funktionelle Untersuchung podozytärer Proteine des Nierenfilters in Drosophila melanogaster für Fragestellungen zum Nephrotischen Syndrom

Abstract

Das Nephrotische Syndrom (NS) ist ein glomerulären Erkrankungen der Niere zugrunde liegender Symptomenkomplex, dessen treibende Kraft das Kardinalsymptom der Proteinurie ist. Definiert als erhöhter Verlust von Eiweißen über den Urin, stellt die Proteinurie das Resultat gesteigerter Permeabilität durch Schädigung des Glomerulus dar. Negative, die Ätiologie umfassende Einflüsse auf die Feinstrukturen des Nierenfilters sind komplex und teilweise nicht vollständig geklärt. Resultierende Erkrankungen sind eine der Hauptursachen für die Entstehung chronischer Nierenerkrankungen. Die Intaktheit des Nierenfilters wird durch die Integrität des Podozyten und der Schlitzmembran sowie das dazwischenliegende engmaschige Signalnetzwerk bestimmt. Eine physiologische Funktionsweise vorausgesetzt, sorgen molekulare Bestandteile für Urin, der nur in geringen Mengen Proteine enthält und somit für das Verhindern der Ausbildung proteinurischer Nierenerkrankungen. Über die statische Filtrationsarbeit hinaus, kommt der Schlitzmembran eine fundamentale dynamische Schlüsselrolle zu, die Signaltransduktionswege zur Kommunikation mit dem Podozyten beinhaltet. Einwandfrei funktionierende Zellprozesse innerhalb des Podozyten, der als postmitotischer Zelltyp in Bezug auf seine Regenerationsfähigkeit deutlich eingeschränkt ist, gewährleisten wiederum die Intaktheit der Schlitzmembran. Kommt es zu molekularen Unstimmigkeiten, sind Pathologien in Form von Instabilität bis hin zum Verlust dieser Komponenten des Nierenfilters die Konsequenz. In der vorliegenden Arbeit wurden podozytäre Proteine des Nierenfilters im Modellorganismus Drosophila melanogaster untersucht und zu Fragestellungen zum Nephrotischen Syndrom genutzt. Mit ITM2B, MERTK und NPR3 und deren Proteinen wurden potentielle Schlitzmembran-Interaktoren beleuchtet. Die Genprodukte von FERMT2, BECN1 und VASN dienten der Untersuchung potentieller Interaktoren biologischer Zellprozesse des Podozyten. Eingeleitet wurde die Arbeit durch bioinformatische Analysen. Nach adäquater Homologfindung erfolgte die Anwendung des Albuminaufnahme-Experiments zur Untersuchung der Beeinflussung des Knockdowns (KD) auf die Filtrationsleistung, die für alle Gene stark reduziert war. Es reihten sich deutlich reduzierte Immunfluoreszenzfärbungen gegen das Drosophila Schlitzmembranmolekül Kirre sowie zellmorphologisch veränderte rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen des Podozyten-ähnlichen Nephrozyten ein. Mittels Immunfluoreszenzfärbungen sowie TEM-Aufnahmen konnte bewiesen werden, dass die Filterbarrieren nach KD aller Gene verändert sind. Zur Beurteilung eines weiteren Organsystems erfolgte die Rasterelektronenmikroskopie des Facettenauges der Fliege. Milde Augenphänotypen, ausgenommen für NPR3, konnten die Bedeutung konservierter Interaktionen unterstreichen. Mit Erfüllung der Zielsetzung wurden innovative Interaktoren der Schlitzmembran sowie der Zellprozesse des Podozyten im Drosophila-Modell aufgedeckt, deren Herunterregulierungen negative Effekte auf Funktionsweise und Morphologie der Filterbarriere nach sich zogen. Basierend auf diesen Befunden eröffnet sich die Möglichkeit für weiterführende Experimente, die das Ziel beinhalten, spezifische Therapieansätzen für Patienten mit Nephrotischen Syndrom zu entwickeln.

The Nephrotic Syndrome as a complex of symptoms underlying glomerular diseases of the kidney, is strongly ruled by the cardinal symptom of proteinuria. Defined as an increased loss of proteins, proteinuria is the result of a raise in permeability due to glomerular impairment. Negative impacts on the microstructure of the kidney are extensive and partially unexplained. Glomerular diseases are the main cause for the development of chronic kidney diseases. The integrity of the kidney filter is determined by the integrity of the podocyte and its slit diaphragm as well as the tightly regulated signaling hub in between. Molecular components are responsible for preventing proteinuric kidney diseases and thereby for urine that contains only low amounts of proteins. Moreover, the slit diaphragm owns a highly dynamic key role regarding signaling pathways as a communication with the podocyte. The podocyte as a post-mitotic type of cell with its limited capacity of regeneration, depends on functioning cell processes that are responsible for the integrity of the slit diaphragm. Molecular alterations lead to pathologies such as instability or even loss of components of the kidney filter. In this work, podocyte proteins were investigated in Drosophila melanogaster as model organism and were applied for questions regarding Nephrotic Syndrome. The expressed proteins of ITM2B, MERTK and NPR3 present potential slit diaphragm interactors. The gene products of FERMT2, BECN1 and VASN serve as potential interactors for the investigation of biological cell processes within the podocyte. Bioinformatical gene comparisons were used to initiate the work. After detection of appropriate homologues, the albumin uptake experiment was applied to evaluate the filtration function, which was highly reduced after knockdown of all genes. Following investigations showed strikingly reduced immunofluorescence stainings against Kirre as Drosophila slit diaphragm molecule as well as morphologically altered podocyte-like nephrocytes in scanning electron microscopy. For presenting the slit diaphragm, immunofluorescence stainings of the cell surface as well as transmission electron microscopy demonstrated altered filtration barriers. For the evaluation of a further organ system, the scanning electron microscopy of the compound eye of the fly presents another method applied in this work. Mild phenotypes of the compound eye, except for NPR3, underlined the meaning of highly conserved interactions. By performance of the objective target, innovative interactors of the slit diaphragm and podocyte cell processes were revealed in Drosophila, whose knockdown resulted in negative effects regarding functionality and morphology of the filtration barrier. The novel discoveries of this work can serve as a platform for further investigations for potentially innovative therapy options in the future, that can be used for treatment approaches based on the specific need of patients suffering from Nephrotic Syndrome.