Protonation and Reduction Dynamics in [FeFe]-Hydrogenases

Abstract

Hydrogenases are metalloenzymes that catalyze uptake and release of molecular hydrogen. Redox chemistry takes place at a Ni- or Fe-metallic cofactors characteristic for hydrogenases. [FeFe]- hydrogenases are of special interest due to high H2 turnover rates at low overpotential and serve as an inspiring model for the design of synthetic catalysts. The active site, called "H-cluster", consists of a canonical [4Fe-4S] cluster linked to the eponymous diiron site. The two Fe ions proximal (Fep) and distal (Fed) to the [4Fe-4S] cluster are ligated by one CN and CO ligand, respectively. Both Fe ions are bridged by a CO ligand (μCO) and by an azadithiolate (adt) group that serves as lewis base to Fed where turnover takes place. The molecular proceedings of hydrogen turnover are under debate. Besides the oxidized, active-ready state (Hox) two increasingly reduced states have been proposed. Two states reduced by one electron are reported, either reduced at the diiron site (Hred) or at the [4Fe-4S] cluster (Hred’). The two-electron reduced species Hsred resembles Hred with an additional reduction of the [4Fe-4S] cluster. Hhyd, a formally two-electron reduced redox species is supposed to be key intermediate in hydrogen turnover, featuring a terminal bound hydride ideal to interact with a proton shared via adt group and the proton transfer path. However the interplay of protein and cofactor, protons and electrons and the role of active site geometry in hydrogen turnover is still not fully understood. Infrared spectroscopy is particularly sensitive to the CO- and CN ligands of the diiron site and enables monitoring even small changes in electron density as for example protonation in the vicinity of the active site. A protocol for specific isotopic editing of individual CO ligands at the diiron site was developed. Correlation with DFT calculations offered the possibility to reveal alterations in cofactor arrangement. Hereby, a bridging hydride geometry was confirmed for Hred and Hsred that features an apical CO ligand at Fed. The enhanced stability of this cofactor arrangement disfavors their catalytic relevance. In contrast, the bridging CO geometry identified for Hred’ preserves the apical vacancy preferred for turnover. Protonation at the [4Fe- 4S] cluster was found to stabilize this geometry and level the redox potential for a second reduction step. H/D exchange experiments confirmed the enrichment of Hhyd in native enzyme that was accompanied by protonation at the [4Fe-4S] as well. A catalytic cycle for hydrogen turnover is proposed that exclusively consists of states with conserved geometry (Hox, Hred’ and Hhyd). Concerted protonation and reduction at the [4Fe-4S] cluster appear to maintain this geometry. Efficient catalysis is not restricted to the diiron site but also influenced by the protein environment that offers a remote protonation site. Synthetic catalysts should exploit the regulative effects offered by protonable redox ligands.

Hydrogenasen katalysieren die Aufnahme und Abgabe von molekularem Wasserstoff (H2). Die Redoxchemie dieser Metalloenzyme findet an Nickel- oder Eisen- Kofaktoren statt. [FeFe]-Hydrogenasen zeigen hohe H2-Abgaberaten und dienen als inspirierendes Modell für das Design synthetischer Katalysatoren. Das aktive Zentrum, der sogenannte ”H-cluster”, besteht aus einem klassischem [4Fe-4S] Zentrum, verbunden mit einem in der Natur einzigartigen Eisen-Eisen- Komplex ([FeFe]). Die zwei Eisen-Ionen proximal (Fep) und distal (Fed) zum [4Fe-4S] Zentrum binden jeweils einen CO- und einen CN-Liganden. Beide Eisen- Ionen werden durch einen dritten CO-Liganden verbrückt und binden zusätzlich eine Azadithiolat-Gruppe (adt), deren sekundäres Amin mit Fed ein frustriertes Lewis-Paar bildet. Die molekularen Details der Wasserstoffkatalyse werden in der Literatur kontrovers diskutiert. Neben dem oxidierten Grundzustand (Hox) sind vier zunehmend reduzierte Intermediate vorgeschlagen worden, darunter zwei einfach reduzierte Zustände, Hred und Hred’. Dabei ist Hred durch eine Reduktion des [FeFe] Zentrum charakterisiert worden, während Hred’ durch Reduktion des [4Fe-4S] Zentrum gekennzeichnet ist. Der zweifach reduzierte Zustand Hsred ähnelt Hred, zeigt aber ein zusätzlich reduziertes [4Fe-4S] Zentrum. Hhyd, ein formal zweifach reduzierter Zustand, wurde als wichtiges Intermediat in derWasserstoffkatalyse vorgeschlagen. Terminal an Fed bindet der H-cluster hier eine hydridische Spezies, die mit dem Proton der adt-Gruppe instantan zu H2 reagieren kann. Die adt-Gruppe ist der Schnittpunkt von H-cluster und Protonentransferpfad. Das genaue Zusammenspiel von Protein und Kofaktor, Protonen und Elektronen und die Rolle der Struktur des aktiven Zentrums sind bisher nicht hinreichend verstanden. Infrarotspektroskopie eigent sich ideal für die Analyse von Hydrogenasen. Die CO- und CN Liganden des [FeFe] Zentrums absorbieren intensiv im mittleren Infrarot und überlappen nicht mit den Absorptionsbanden von Protein oder flüssigem Wasser. Dadurch können auch kleinste Änderungen in der Elektronendichteverteilung detektieren werden, beispielsweise die Bindung eines Protons in der Nähe des H-clusters. Es wurde ein photochemisches Protokoll entwickelt, um die natürlichen 12CO- Liganden den [FeFe] Zentrums selektiv gegen 13CO auszutauschen (Isotopenmarkierung). In Korrelation mit DFT Rechnungen war es möglich, die Kofaktorgeometrie mit hoher Präzision aufzulösen, so dass auch subtile Unterschiede, die in der Proteinkristallographie verloren gehen, enhüllt werden konnten. Erstmals wurde so zum Beispiel eine Kofaktorgeometrie mit einem verbrückenden Hydrid für Hred und Hsred bestätigt. Ein daraus resultierender apikaler CO Ligand und die erhöhte Stabilität des verbrückenden Hydrides machen eine katalytische Relevanz dieser Zustände unwahrscheinlich. Im Gegensatz dazu wurde für Hred’ ein verbrückender CO Ligand und damit die apikale Vakanz am distalen Eisen-Ion bestätigt. Die Beibehaltung dieser, von Hox bekannten, „konservativen“ Struktur ist von zentraler Bedeutung für eine effiziente Wasserstoffkatalyse. Eine Protonierung am [4Fe-4S] Zentrum stabilisiert die konservative Geometrie in Hred’ und dämpft das Redoxpotential für den zweiten Reduktionsschritt. H/D-Austauschexperimente bestätigten die Anreicherung von Hhyd in nativem Enzym. DFT Rechnungen suggerieren auch für Hhyd ein Protonierung am [4Fe-4S] Zentrum. Ein katalytischer Zyklus, der nur Zustände mit konservativer Geometrie berücksichtig konnte formuliert werden (Hox, Hred’, und Hhyd). Eine aufeinander abgestimmte Protonierung und Reduktion am [4Fe-4S] Zentrum scheinen die Geometrieerhaltung zu unterstützen. Für die Entwicklung synthetischer Katalysatoren sollten diese regulatorischen Effekte in Betracht gezogen werden, zum Beispiel durch protonierbare Redoxliganden, die eine vorzeigtige Reduktion und Bildung verbrückender Hydride am bimetallischen Zentrum verhindern.