Einfluss autologer osteogen prädifferenzierter mesenchymaler Stammzellen auf die Knochenheilung im atrophen Pseudarthrose-Modell der Ratte

Abstract

Diaphysäre atrophe Pseudarthrosen weisen oftmals ungünstige biologische Ausgangsbedingungen zur Heilung auf. Der Grund liegt in einer häufig erheblich beeinträchtigten vaskulären Versorgung des Knochengewebes in Folge des vorangegangenen Traumas (Kasperczyk et al., 1996). Eine Heilung des Knochens kann in dieser Situation nur nach chirurgischer Intervention erreicht werden (Gebauer et al., 2005). Der derzeitige »Goldstandard« der Behandlung besteht in einer stabilisierenden Osteosynthese in Kombination mit allogener/autologer Spongiosa-Transplantation (Braun et al., 1996). Die Therapie führt jedoch oftmals nur nach wiederholten Eingriffen zum Erfolg. Neben hohen sozio- ökonomischen Kosten bedeutet dies vor allem eine lange Rekonvaleszenz für den betroffenen Patienten, welche mit erheblichen physischen sowie nicht selten auch psychischen Belastungen verbunden ist. Darüber hinaus sind wiederholt erforderliche Operationen stets mit einem erhöhten Risiko, besonders für gesundheitlich vorbelastete Personen, verbunden. Der Erforschung alternativer, minimal invasiver Therapiemethoden gestörter Knochenheilung gilt daher die besondere wissenschaftliche Aufmerksamkeit. Der Einsatz mesenchymaler Stammzellen (MSCs) wird in diesem Zusammenhang praktisch, ethisch und immunologisch als unbedenklich angesehen (Rauner et al., 2007) und stellt somit einen hoffnungsvollen Ansatz im Bereich minimal invasiver osteoregenerativer Medizin dar (Izadpanah et al., 2005). Innerhalb der vorliegenden Studie wurde der Einsatz autologer osteogen prädifferenzierter mesenchymaler Stammzellen auf die Knochenheilung untersucht. Die Zielsetzung der Studie bestand in einer Untersuchung des Einflusses der daraus resultierenden Osteoprogenitorzellen (OPCs) auf die Osteoregeneration bei massiv verminderter Bioaktivität des Knochengewebes, wie sie im Falle einer atrophen Pseudarthrose vorliegt. Zur Durchführung der Studie wurden 32 männliche, adulte Ratten randomisiert in zwei gleichgroße Gruppen (Versuchsgruppe, Kontrollgruppe) eingeteilt. Allen Tieren wurde Knochenmark aus der Tibia entnommen. Aus dem Aspirat der Versuchsgruppe wurden MSCs fraktioniert, in vitro expandiert und zu osteogenen Vorläuferzellen (OPCs) prädifferenziert. Im Anschluss erfolgte die standardisierte Osteotomie des Femurs in der Diaphysenmitte bei allen Tieren, welche mittels unilateralem Fixateur extern stabilisiert wurde. Zur Induktion einer atrophen Pseudarthrose-Situation erfolgte die thermische Zerstörung des Periosts 2 mm proximal und distal des Osteotomiespaltes sowie die Entnahme des Knochenmarks im Bereich der Osteotomie. Zwei Tage post operationem (p.o.) wurde den Tieren der Versuchsgruppe perkutan eine Suspension bestehend aus ca. 2 x 106 autologen OPCs/0,1 ml Expansionsmedium lokal in den Osteotomiespalt appliziert (OPC-Gruppe). Den Kontrolltieren wurde allein ein äquivalentes Volumen des Expansionsmediums lokal injiziert (Medium-Gruppe). Am Tag der Osteotomie sowie auch im Rahmen einer wöchentlich vorgenommenen Wundkontrolle wurden radiologische Aufnahmen angefertigt. Zwei Wochen p.o. wurden die Femora aller Tiere gewonnen und histologischen, histomorphometrischen sowie immunhistologischen Untersuchungen unterzogen. Die radiologische und histologische Auswertung ließ eine erfolgreich induzierte Verzögerung der Knochenheilung nach Art einer beginnenden atrophen Pseudarthrose erkennen. Die Untersuchungen erbrachten im Weiteren eine signifikant größere Fläche periostalen Kallusgewebes [%] binnen der OPC-Gruppe sowie innerhalb dessen einen ebenso signifikant größeren Anteil hyalinen Knorpelgewebes [%] im medialen periostalen Knochenareal der Versuchsgruppe gegenüber der Kontrollgruppe. Die detektierten Anteile (mineralisierten) Knochen- und Bindegewebes entsprachen sich hingegen zwischen den Gruppen. Anhand der ermittelten Ergebnisse konnte durch die lokale Applikation autologer osteogen vordifferenzierter Zellen in den Spalt einer Osteotomie bei massiv beeinträchtigter Vitalität des Knochengewebes zwei Wochen nach Transplantation der OPCs eine Stimulation der Knochenregeneration festgestellt werden. Der Einfluss der Zellen beschränkte sich dabei jedoch auf das mediale periostale Knochenareal und erfolgte ausschließlich nach Art beginnender enchondraler Ossifikation. Darüber hinaus deutete sich eine Beteiligung des sich rekonstruierenden Periosts am ermittelten Effekt der OPCs an. Die Applikation der Zell-Medium-Suspension zu einem späteren Zeitpunkt und/oder auch eine wiederholte Injektion der OPCs in Verbindung mit dem Einsatz eines visköseren Suspensions-Mediums könnten hier zur Optimierung des osteokonduktiven Stimulus beitragen.

Diaphyseal atrophic non-unions often show biologically disadvantageous conditions for healing. An insufficient vascular supply of the fractured bone as a result of a preceding trauma is considered the main course (Kasperczyk et al., 1996). In such a situation, bone regeneration cannot be achieved without surgical intervention (Gebauer et al., 2005). The current »golden standard« for treatment is to provide a stabilizing osteosynthesis in combination with transplantation of autologous/allogen spongiosa (Braun et al., 1996). However, this kind of therapy does not always guarantee healing. Beside high socio- economic costs, a failure in bone healing is associated with a prolonged recovery time and therefore patient suffering. Moreover repeated surgical interventions may be a risk factor, especially for medically compromised patients. Therefore, over the past years medical science has focused on minimally invasive methods for treatment of delayed and non-unions. In this context, the use of mesenchymal stem cells (MSCs) is considered to be practically, ethically and immunologically inoffensive (Rauner et al., 2007). Thus MSCs represent a promising approach for minimally invasive therapies to enhance bone regeneration (Izdapanah et al., 2005). The present study analyzed the influence of autologous MSCs predifferentiated into the osteogenic lineage in vitro on bone healing. The aim of this study was to examine the therapeutic potential of locally transplanted autologous osteoprogenitor cells (OPCs) in a biologically unreactive fracture situation. Therefore, 32 male adult Sprague DawleyTM rats were randomly devided into two groups, each 16 animals (experimental group, control group). All animals received a tibial bone marrow aspiration. Isolated MSCs were cultured in vitro and predifferentiated into the osteogenic lineage. In all animals, a standardized midshaft osteotomy of the femur diaphysis was performed and stabilized with a monolateral external fixator. An atrophic non-union was induced by thermal destruction of the periosteum 2 mm proximally and distally to the osteotomy gap and bone marrow removal. Two days after surgery, the experimental group received a percutaneous injection of approximately 2 x 106 OPCs/0,1ml expansion medium into the osteotomy gap, whilst the control group was treated with an equivalent volume of pure expansion medium. X-rays were taken directly postoperatively as well as at one and two weeks after surgery. After two weeks, the femora of all animals were explanted and processed for histological/histomorphometrical and immunohistochemical analysis. Radiological and histological examination demonstrated a delay in bone healing. By histomorphometrical analysis, a significantly higher area of the periosteal callus and a higher fraction of cartilage in the periosteal callus at the medial side was found in the experimental compared to the control group. However, there was no difference in the fraction of (mineralized) bone and connective tissue between both groups. The present study demonstrates that percutaneously injected autologous OPCs slightly improved the healing of an atrophic non-union. But, the effect was limited to an incipient endochondral ossification in the periosteal callus on the medial side. The results further illustrate a participation of the beginning reconstruction of the periosteum in the effect of the OPCs. Application of OPCs at a later time point after osteotomy or re-injection of the cells, combined with a more viscous suspension medium, might lead to a more pronounced osteogenic effect.